阿托伐他汀通过SIRT1/NADPH氧化酶对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化损伤作用*

曹娜，葛力萁，程明月，张卓琦，王志荣

阿托伐他汀通过SIRT1/NADPH氧化酶对抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞的氧化损伤作用*

曹娜，葛力萁，程明月，张卓琦，王志荣

目的：探讨阿托伐他汀(atorvastatin, Atv)通过SIRT2沉默信息调节因子家族成员之一的SIRT1/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶对高糖环境下人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化损伤的作用。

高糖；阿托伐他汀；人脐静脉内皮细胞；氧化应激；SIRT1；NADPH氧化酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1000.)

当今，动脉粥样硬化及糖尿病成为威胁人类健康的两大杀手，糖尿病患者发生动脉粥样硬化的风险增加。糖尿病患者体内具有较高的氧化应激水平，而氧化应激参与了血管内皮细胞病理生理变化过程的各个环节，是动脉粥样硬化病变的基础[1-3]。血糖升高作为糖尿病的特征表现，主要通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的活性增加，进而引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加，对血管内皮产生氧化应激损伤，促进动脉粥样硬化的形成[4]。目前已发现NADPH氧化酶（NOX）有5种同源家族体，分别为NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4和NOX5，而内皮细胞产生的活性氧主要来源于NOX4[5]。SIRT1是Sir2（silent information regulator2沉默信息调节因子）家族成员之一，在抵抗氧化应激，延缓衰老，延长寿命等方面发挥重要作用。SIRT1的过表达能阻止氧化应激诱导的人内皮细胞的衰老[6-7]。阿托伐他汀为第三代β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶 A(HMG-CoA) 还原酶抑制剂，广泛应用于临床，其除具有降脂作用外，还具有如抗炎、抗氧化、抗衰老、改善动脉粥样硬化等作用[8,9]。但阿托伐他汀是否通过调节SIRTl表达，从而发挥抗氧化应激、改善动脉粥样硬化的作用尚少见报道。本研究旨在探讨这一观点的，为阿托伐他汀心血管保护作用提供进一步的依据。

1 材料与方法

主要材料：人脐静脉内皮细胞株 (American type culture collection, ATCC)；阿托伐他汀原药粉(Sigma，美国)；胎牛血清（Gibco，澳大利亚）；低糖型DMEM (Hyclone，美国)；甘露醇、D-葡萄糖、SIRT1抑制剂sirtinol、NOX4抑制剂apocynin(Sigma，美国)；BCA蛋白试剂盒、CCK-8试剂盒、活性氧检测试剂盒(碧云天公司生物技术公司)；兔抗人SIRT1 单克隆抗体（Abcam，美国）；兔抗人NOX4多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)；山羊抗兔及马抗鼠碱性过氧化物酶抗体均购自武汉博士德生物技术有限公司。

细胞培养与分组：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）细胞株在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和链霉素的低糖型DMEM培养基中培养，当细胞长至70%～80%时，换不含血清的低糖型DMEM培养基继续培养24 h，使细胞同步于静止生长期（G0/G1期）后分组：①正常组（葡萄糖5.6 mmol/L）；②渗透压对照组（葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇27.7mmol/L）；③高糖组（葡萄糖33.3 mmol/L）；④高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀组；⑤高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀组；⑥高糖+10.0 μmol/L阿托伐他汀组；⑦高糖+SIRT1抑制剂组；⑧高糖+ NOX4抑制剂组。

细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测血管内皮细胞的增殖能力[10]：HUVECs由0.25%胰酶消化后在显微镜下计数，以每孔5×104接种于96孔板，待细胞贴壁，换无血清培养基继续培养24 h后，予以对应处理继续培养24 h，避光状态下每孔加入CCK-8 10 μl，37℃培养箱继续孵育2 h后，锡箔纸包好96孔板，酶标仪测定吸光度值（A450），实验重复3次，用吸光度值表示细胞的增殖能力。

流式细胞术检测细胞内活性氧水平[11]：细胞干预结束后，于培养基中加入荧光探针CM-H2DCFDA至终浓度为5 μmol/L，37℃、5% CO2培养箱内培养30 min，吸去培养基，无血清培养基洗细胞3次，充分去除未进入细胞的CM-H2DCFDA，之后用0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液，无血清培养基洗2遍，磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，流式细胞仪检测活性氧，激发光488 nm，发射光525 nm。上述步骤严格按照试剂盒说明书操作。

蛋白免疫印迹（Western blot）检测SIRT1和NOX4的表达：提取细胞总蛋白，BCA法[12]测定蛋白浓度后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后室温下封闭，用特异性抗SIRT1及NOX4抗体进行免疫杂交检测，β肌动蛋白（β-actin）作为内参照，化学发光剂显色，最后对目的条带进行扫描机密度分析。每组重复3次。

2 结果

阿托伐他汀对高糖环境下HUVECs增殖的影响：CCK-8结果显示，与正常组相比，高糖各组（高糖组、高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀组、高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀组、高糖+10.0 μmol/L阿托伐他汀组）干预24 h后内皮细胞的增值能力明显下降（光密度值下降），差异均有统计学意义（P均＜0.05）；且高糖各组间比较差异也均有统计学意义（P＜0.05）。而渗透压对照组24 h后内皮细胞增值能力较正常组未见明显改变。表1

表1 阿托伐他汀对高糖环境下人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响

表1 阿托伐他汀对高糖环境下人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响

注：与正常组比较*P＜0.05；与高糖组比较△P＜0.05；与高糖+0.1 μ mol /L阿托伐他汀组比较◆P＜0.05；与高糖+1.0 μ mol /L阿托伐他汀组比较▲P＜0.05

组别 光密度值（A450）正常组 1.291±0.049渗透压对照组 1.228±0.069高糖组 0.782±0.071*高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀组 0.938±0.073*△高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀组 1.056±0.068*△◆高糖+10.0 μmol/L阿托伐他汀组 1.176±0.035*△◆▲

流式细胞仪检测各组细胞内活性氧水平：流式细胞仪检测结果显示，与正常组相比，高糖各组（高糖组、高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀组、高糖+1.0 μmol/L阿托伐他汀组）干预24 h后内皮细胞内活性氧水平明显增加，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；且高糖组与高糖+（0.1、1.0、10.0 μmol/L）阿托伐他汀组之间、高糖+0.1 μmol/L阿托伐他汀组与高糖+（1.0、10.0 μmol/L）阿托伐他汀组之间比较，差异也均有统计学意义（P均＜0.05）。渗透压对照组24 h后内皮细胞增值能力（内活性氧水平）较正常组未见明显改变。图1

蛋白免疫印迹法检测各高糖组细胞SIRT1、NOX4蛋白的表达：图2示，高糖组较正常组SIRTl蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；渗透压对照组与正常组相比SIRTl蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；高糖+（0.1、1.0、10.0 μmol/L） 阿托伐他汀各组与高糖组相比SIRTl蛋白表达明显增加差异均有统计学意义（P均＜0.05）。图3示，高糖组较正常组NOX4蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），渗透压对照组与正常组相比NOX4蛋白表达无明显变化（P＞0.05）；高糖+（1.0、10.0 μmol/L）阿托伐他汀各组与高糖组相比NOX4蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图1 流式细胞仪检测各组细胞内活性氧水平（n=3）

图2 蛋白免疫印迹法检测各高糖组细胞SIRT1蛋白的表达（n=3）

图3 蛋白免疫印迹法检测各高糖组细胞NOX4蛋白的表达（n=3）

sirtino1及apocynin对高糖诱导下HUVECs SIRT1及NOX4蛋白表达的影响：图4示，高糖+SIRTI抑制剂组（sirtinol，50.0 μmol/L） 较高糖组SIRT1蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.05），高糖+NOX4抑制剂组（apocynin，100.0 μmol/L）较高糖组SIRT1蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。图5示，高糖+SIRTI抑制剂组（sirtinol，50.0 μmol/L） 较高糖组NOX4蛋白表达增加（P＜0.05），高糖+NOX4抑制剂组（apocynin，100.0 μmol/L）较高糖组NOX4蛋白表达减少（P＜0.05）,差异均有统计学意义。

图4 蛋白免疫印迹法检测sirtinol和apocynin组细胞SIRT1蛋白的表达（n=3）

图5 蛋白免疫印迹法检测sirtinol和apocynin组细胞NOX4蛋白的表达（n=3）

3 讨论

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是由于脂肪、血栓、结缔组织和碳酸钙在血管（主要是动脉，但也包括静脉）沉积所造成的一种对人体有害的状态，严重威胁着人类的健康，了解动脉粥样硬化形成和发展相关机制，寻找相应的药物治疗靶点，对动脉粥样硬化的预防和治疗无疑具有重要的意义。但截至目前为止，动脉粥样硬化的发病机制尚未明确，不过自Ross[13]于1999年提出“内皮损伤反应学说”以来，越来越多的研究者认识到，AS的形成与发展是一种慢性血管炎性反应过程，且氧化应激在其中扮演了重要的角色，参与了血管内皮细胞病理生理变化过程的各个环节，被认为是动脉粥样硬化病变的基础[1-3]。血糖升高作为糖尿病的特征表现，可以进一步加重内皮细胞的氧化应激损伤[14,15]。

血管内皮中氧化应激损伤主要源于线粒体电子传递链、一氧化氮合酶、NADPH氧化酶等多种途径产生的活性氧，而NOX是内皮细胞内活性氧最主要的来源[16]。近几年在对各种组织的研究中发现NOX有5种同源家族体，分别称为NOX1、NOX2（gp91phox）、NOX3、NOX4和NOX5，血管内皮细胞主要表达其中的NOX2和NOX4，且NOX4表达水平比NOX2高约20倍。进一步的研究显示，血管内皮细胞产生的活性氧主要来源于NOX4[5]。

他汀即β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA) 还原酶抑制剂的发展是冠心病治疗史上的重要里程碑，除具有降脂作用外，还具有如抗炎、抗氧化、改善动脉粥样硬化及保护血管内皮细胞等作用[8,9]。阿托伐他汀作为第三代他汀药物，广泛作用于临床，大规模的临床研究证实，阿托伐他汀能明显降低心血管事件的发生率，其临床获益除降脂作用外，还与其抗氧化应激、改善内皮细胞功能、抗炎等脂外作用密切相关。Usharani 等[17]通过对口服阿托伐他汀的2型糖尿病患者进行临床研究，发现阿托伐他汀可以降低2型糖尿病患者丙二醛、ET-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，从而达到其保护内皮细胞功能的作用。Roberto等[18]发现，在高胆固醇血症的人群中，阿托伐他汀可以通过抑制PKC的激活，降低NADPH氧化酶的表达，对抗氧化应激来实现其心血管保护作用。

本实验中，一方面分别应用低糖（5.7 mmol/L）、高糖（33.3 mmol/L）、甘露醇（27.7 mmol/L）作用于HUVEC，利用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞仪检测活性氧生成，Western-Blot法检测NOX4的表达。结果显示，与正常低糖组比较，高糖可以抑制HUVEC的增殖，升高NOX4的表达，增加细胞内活性氧水平，而甘露醇对照组却没有上述改变，说明高糖可以诱导HUVECs产生氧化应激损伤，其作用与高糖自身代谢有关，而与渗透压无关。另一方面，先予以不同浓度阿托伐他汀（0.1 μmol/L、1.0 μmol/L、10.0 μmol/L）预处理1小时，再加入葡萄糖（27.7 mmol/L）共同作用23小时，再利用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞仪检测活性氧生成，Western-Blot法检测NOX4的表达。结果显示，与高糖组比较，阿托伐他汀可以改善高糖对HUVECs增殖的抑制作用，降低NOX4表达，减少细胞内活性氧水平，并呈浓度依赖性。提示阿托伐他汀对NADPH氧化酶表达的调控作用是其在高糖环境下抑制氧化应激的重要机制之一。

SIRT1是Sir2（silent information regulator2沉默信息调节因子）家族成员之一，在转录沉寂、染色质稳定、双链DNA断裂损伤后生理修复、以及延长细胞周期中起重要作用，具有组蛋白去乙酰化活性，调节机体的寿命[19]。随着年龄的增加，SIRTl在体内的表达明显下降，敲除SIRTl小鼠寿命明显缩短。SIRTl的过表达能阻止氧化应激诱导的人内皮细胞的衰老[6,7]。总之，SIRT1在抵抗氧化应激，延缓衰老，延长寿命等方面发挥重要作用。他汀类药物广泛用于临床，具有降脂，抗炎，抗氧化，抗动脉硬化，保护内皮功能等作用。他汀类药物是否通过SIRT1发挥作用成为近年来研究的热点。Ota等[20]研究显示他汀(阿托伐他汀、普伐他汀和匹伐他汀)可以抑制小鼠主动脉内皮细胞的衰老，通过激活一氧化氮合酶（eNOS）、升高SIRT1表达来实现。本研究通过阿托伐他汀作用于高糖损伤的HUVECs，发现阿托伐他汀可以升高高糖作用下HUVECs 的SIRT1蛋白的表达，实现其对抗高糖诱导的内皮细胞的损伤的作用。

SIRT1在抵抗氧化应激，延缓衰老，延长寿命等方面发挥重要作用。NOX4是NOX一种，是血管内皮细胞产生活性氧最主要的来源。升高SIRT1的表达或降低NOX4的表达均可降低细胞内活性氧的水平，对抗氧化应激，延缓衰老，但这两者之间是否有关联，目前尚未明确。本研究通过加用SIRT1及NOX4的抑制剂发现，当SIRT1的活性被抑制时，NOX4的表达增加，而当NOX4活性被抑制时，SIRT1的表达未见明显异常，提示SIRT1可能在NADPH氧化酶的上游发挥对抗高糖诱导的内皮细胞氧化损伤作用。

总之，本研究发现阿托伐他汀通过提高HUVECs的SIRT1蛋白的表达，实现其在高糖环境中抑制血管内皮细胞内NADPH氧化酶活性及下调细胞内活性氧水平，从而对抗高糖对血管内皮细胞产生的氧化应激损伤。

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Atorvastatin Inhibits High Glucose-induced Oxidative Stress Injury in Human Umbilical Vein Endothelial Cells by SIRT1/NADPH Oxidase Pathway

CAO Na, GE Li-qi, CHENG Ming-yue, ZHANG Zhuo-qi, WANG Zhi-rong.
Department of Cardiology, The Aff i liated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou (221000), Jiangsu, China

WANG Zhi-rong, Email:xzzrw@163.com

Objective: To explore the effect of atorvastatin (Atv) on high glucose-induced oxidative stress injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by SIRT1/NADPH oxidase pathway with the possible mechanisms.Methods: HUVECs were cultured in low glucose medium and then divided into 6 experimental groups: ①Normal group,②Osmotic pressure control group, ③High glucose (HG) group, ④HG+ Atv (0.1, 1.0, 10.0) μmol/L group, ⑤HG+sirtinol (SIRT1 inhibitor) group, ⑥HG+apocynin (NOX4 inhibitor) group, and HUVECs were further cultured for 24 hours. The cell proliferation was examined by CCK-8 kit, ROS level was detected by fl ow cytometry method, protein expressions of SIRT1 and NOX4 were measured by Western blot analysis.Results:① Compared with Normal group, HG group had decreased HUVECs proliferation, Atv improved the HG inhibited proliferation in a does dependent manner.② HG group had the higher level of ROS, increased NOX4 protein expression and decreased SIRT1 protein expression.③ In HG condition, Atv up-regulated SIRT1 expression and downregulated ROS and NOX4 expressions in a does dependent manner.④In HG condition, sirtinol decreased SIRT1 expression, increased NOX4 expression, and apocynin decreased NOX4 expression, while it had no inf l uence on SIRT1 expression.Conclusion: Atorvastatin could resist HG-induced oxidative stress injury in HUVECs, which might be related to up-regulated SIRT1 expression, and SIRTI plays the role in NADPH oxidase at upstream.

High glucose; Atorvastatin; Human umbilical vein endothelial cells; Oxidative stress; SIRT1; NADPH oxidase

2014-02-20）

（编辑：梅平）

江苏省兴卫工程医学重点人才资助项目（项目编号：RC 2007089）

221000 江苏省徐州市，徐州医学院附属医院 心内科

曹娜 住院医师 硕士 主要从事冠心病防治的基础与临床研究 Email: nana2011two@163.com 通讯作者：王志荣 Email: xzzrw@163.com

R541

A

1000-3614（2014）12-1000-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.011

方法：人脐静脉内皮细胞株低糖（5.6 mmol/L）培养贴壁后随机分为正常组、渗透压对照组、高糖组、高糖+（0.1、1.0、10.0 μ mol/L）阿托伐他汀组、高糖+SIRT1抑制剂（sirtinol）组及高糖+ NOX4抑制剂（apocynin）组，继续培养24 h后应用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）的水平， 蛋白免疫印迹法检测细胞中SIRTl及NADPH氧化酶4（NOX4）的蛋白水平。

结果：①与正常组相比，高糖各组细胞增殖减低，阿托伐他汀组均可改善高糖对HUVECs增值的抑制作用，呈浓度依赖性。②高糖环境下，细胞内ROS水平显著增加，NADPH氧化酶4的蛋白表达显著上调，SIRTl的蛋白表达明显降低。③阿托伐他汀可以上调高糖环境下SIRTl的表达，降低ROS、NADPH氧化酶4的表达，具有浓度依赖性。④高糖环境下，SIRTl抑制剂sirtinol可以降低SIRTl的表达，增加NADPH氧化酶4的表达，NADPH氧化酶4抑制剂apocynin可降低NADPH氧化酶4的表达，但对SIRT1的表达无明显影响。

结论：阿托伐他汀可以对抗高糖诱导的HUVECs的氧化损伤，其可能的机制与升高内皮细胞SIRT1的表达有关，且SIRT1在NADPH氧化酶的上游发挥对抗高糖诱导的氧化损伤作用。