阿托伐他汀对稳定性心绞痛患者血浆微小核糖核酸-143/145表达水平的影响

赵蓓，刘利峰，刘瑛琪，刘莉，赵京涛，周莉，夏会会，王守力

阿托伐他汀对稳定性心绞痛患者血浆微小核糖核酸-143/145表达水平的影响

赵蓓，刘利峰，刘瑛琪，刘莉，赵京涛，周莉，夏会会，王守力

目的：探讨阿托伐他汀对稳定性心绞痛患者血浆微小核糖核酸（microRNA）-143/145表达水平的影响。

阿托伐他汀；微小核糖核酸；稳定性心绞痛

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:972.)

虽然药物洗脱支架大大降低了冠状动脉介入术后再狭窄的发生率，但由于接受支架治疗的患者数量逐年递增，实际上每年检查出来的支架内再狭窄患者例数依然呈上升的趋势，支架内再狭窄已经成为影响冠心病患者远期预后的主要问题之一[1,2]。目前认为，支架内再狭窄的主要病理生理机制是，支架部位血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移[3,4]。微小核糖核酸-143/145（microRNA-143/145)在血管平滑肌细胞增殖中有重要作用，与支架内再狭窄的关系密切[5]。本研究探讨阿托伐他汀对稳定性心绞痛患者血浆microRNA-143/145表达水平的影响。

1 对象与方法

研究对象：入选2012-01至2012-12于我院门诊就诊的冠心病患者74例，男性51例（68.9%），女性23例, 年龄42～73岁，平均（53.6±16.8）岁。随访12～19个月，平均（14.8±4.3）个月。 入选标准：①首次诊断冠心病稳定性心绞痛；②入组之前未服用过他汀类药物；③年龄18～70岁。排除标准：①肿瘤；②预期寿命＜1年；③结缔组织病；④接受透析；⑤肝酶异常。所有入组患者在服用阿托伐他汀之前、服药1个月以及服药12个月时均检测三大常规、肝肾功能、血脂、C反应蛋白等。所有患者均签署知情同意书。

方法：74例患者按纳入顺序赋予序号，由统计软件产生随机数分为两组，低剂量组（n=36）, 阿托伐他汀20 mg，每日一次；中等剂量组(n=38), 阿托伐他汀40 mg，每日一次。观察并比较两组患者用药前、用药1个月及用药12个月血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平和microRNA-143/145表达水平的变化。将74例患者按照不同时间点的LDL-C是否达标进行分组，即达标组（LDL-C ＜ 2.60 mmol/L） 和不达标组（LDL-C≥2.60 mmol/L）。

主要试剂与仪器：microRNA提取试剂盒miRNeasy RNA isolation kit 购自德国Qiagen公司，Taqman Universal Master Mix Ⅱ试剂盒和Taqman microRNA探针购自美国ABI公司；其他试剂如氯仿、无水酒精等均为实验室常规试剂；反转录仪及实时定量聚合酶链式反应（PCR）扩增仪均为美国ABI公司产品，NanoDrop 2 000c紫外分光光度计为美国Thermo公司产品。

检测指标：74例患者在服用阿托伐他汀之前、用药1个月和12个月时留取血样，抗凝管静脉取血10 ml，4 h内离心，离心条件：室温，1 800 g，10 min，取上层血浆4 ml于-80℃冻存备用。核糖核酸（RNA）分离及纯化：血浆于冰上解冻后取200 μl用于提取总RNA。按miRNeasy RNA isolation kit说明书操作，收集RNA洗提液（大约12 μl），于-20℃冻存备用。使用Taqman Universal Master Mix Ⅱ（ABI公司）试剂盒和Taqman microRNA（ABI公司）探针检测microRNA的表达水平。以人类U6RNA作为内参。

数据处理及统计学分析：为研究microRNA-143/145表达水平与LDL-C的关系，依照参考文献[6]，对各样本中目的microRNA的Ct值进行一定的转换：定义每个样品中所测microRNA的平均Ct值为Ct0，每个样品中的每个microRNA的原始Ct减去Ct0得到Ct1，把所有样品中所测的microRNA总的平均Ct值加回Ct1得到Ct2，Ct3＝50-Ct2，从而Ct3值越高说明该microRNA的表达水平越高。采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，Graghpad Prism 5作图软件作图。连续变量采用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；分类变量采用数值和百分比表示，两组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组患者基线资料比较差异无统计学意义。表1

表1 两组患者基线资料比较

表1 两组患者基线资料比较

注：LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇 HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇 ACEI:血管紧张素转换酶抑制剂 ARB:血管紧张素受体拮抗剂 CCB: 钙离子通道阻滞剂

低剂量组(n=36)中等剂量组(n=38) P值年龄 (岁) 52.8 ±15.4 54.4 ±17.3 0.6762男性[ 例 (%)] 26 (72.2) 25 (65.8) 0.5501体重指数 (kg/m2) 25.8 ± 4.6 24.9 ± 3.9 0.3661糖尿病[例 (%)] 8 (22.2) 9 (23.7) 0.8812高血压[例 (%)] 13 (36.1) 16 (42.1) 0.5975吸烟[例 (%)] 10 (27.8) 9 (23.7) 0.6870饮酒[例 (%)] 17 (47.2) 14 (36.8) 0.3657 LDL-C (mmol/L) 3.67±1.24 3.59±1.18 0.7769 HDL-C (mmol/L) 1.01 ± 0.24 1.00 ± 0.22 0.8522甘油三酯 (mmol/L) 1.78 ± 1.38 1.65 ± 1.21 0.7409空腹血糖 (mmol/L) 6.4 ± 2.1 6.6 ± 2.3 0.6977 ACEI[例 (%)] 6 (16.7) 7 (18.4) 0.8429 ARB[例 (%)] 5 (13.9) 5 (13.2) 0.9267 CCB[ 例 (%)] 7 (19.4) 10 (26.3) 0.4825 β受体阻滞剂 [ 例 (%)] 4 (11.1) 6 (15.8) 0.5563

两组患者血浆micro-143/145表达水平（Ct3）、血浆LDL-C变化及比较：两组患者用药1个月时和12个月时血浆microRNA-143/145的水平均较用药前明显升高，差异有统计学意义（ P＜0.05）;两组患者用药12个月与用药1个月时比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中等剂量组在用药1个月与用药12个月时血浆microRNA-143/145表达高于低剂量组；两组患者阿托伐他汀治疗1个月和12月时血浆LDL-C水平较治疗前均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；用药12个月较1个月时血浆LDL-C水平差异无统计学意义（P＞0.05）。表2

血浆LDL-C水平与microRNA-143/145的相关性分析：以microRNA-143为例，两组患者各时间点上血浆LDL-C水平与microRNA-143/145无明显相关性。图1

表2 两组患者用药前后血浆micro-143/145表达水平（Ct3）、血浆LDL-C变化

表2 两组患者用药前后血浆micro-143/145表达水平（Ct3）、血浆LDL-C变化

注：与用药前比较*P＜0.05；与低剂量组比较△P＜0.05。 microRNA：微小核糖核酸 LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

低剂量组 (n=36) 中等剂量组(n=38) microRNA 143用药前 19.4±4.5 18.9±4.5用药1个月 23.7±6.7* 27.9±7.4*△用药12个月 24.1±6.9* 28.3±7.5*△microRNA 145用药前 20.6±4.7 19.8±4.5用药1个月 24.3±6.3* 28.6±7.1*△用药12个月 24.9±6.7* 29.2±7.3*△LDL-C(mmol/L)用药前 3.67±1.24 3.59±1.18用药1个月 2.92±1.15* 2.37±0.96*用药12个月 3.16±1.19* 2.64±1.05*

图1 两组患者不同时间点血浆LDL-C与microRNA-143水平的相关性分析

达标组与未达标组间的血浆microRNA-143/145表达水平的比较：达标组与未达标组microRNA-143/145的表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。表3

表3 达标组与未达标组间的血浆microRNA-143/145水平变化的比较

表3 达标组与未达标组间的血浆microRNA-143/145水平变化的比较

注：括号内为各时间点LDL-C达标或未达标病例数。余注见表2

组别 microRNA-143 microRNA-145用药1个月 用药12个月 用药1个月 用药12个月达标组 26.1±6.9 (51) 26.7±7.1 (43)26.3±6.9 (51) 27.5±7.4 (43)未达标组 25.3±6.5 (23) 25.6±6.8 (31)27.0±7.2 (23) 26.6±7.1 (31)

3 讨论

支架内再狭窄的发生，受多种因素影响，其主要的病理生理机制是平滑肌细胞增殖和迁移，前期的基础研究发现多个microRNA在平滑肌细胞增殖和迁移过程中发挥重要作用，尤以microRNA-143/145最为重要。microRNA-143/145相对特异在血管平滑肌细胞中表达，具有抑制平滑肌细胞增殖和迁移的作用[7]，敲除microRNA-143/145后，小鼠主动脉和股动脉血管壁平滑肌细胞发生明显增殖[8]。在另外一项研究中，作者发现，随着再狭窄的进展，局部血管内膜和中膜的microRNA-143/145的表达水平呈进行性下降[9]。进一步研究发现过表达microRNA-145有利于冠状动脉粥样硬化斑块的稳定。近期的研究则认为，循环microRNA-143/145的表达水平与冠状动脉病变的严重程度相关，病变越重其表达水平越低。事实上，目前逐步开展的临床试验研究发现，大约有1/3的支架内再狭窄并不是典型的平滑肌细胞过度增殖，而是支架内发生了新的动脉粥样硬化斑块[10]。前述研究提示microRNA-143/145可能在平滑肌细胞增殖和动脉粥样硬化斑块形成中都发挥重要着用，因此提示我们microRNA-143/145很有可能是冠心病患者支架术后再狭窄的重要作用分子，有必要进行深入的临床研究。

他汀类药物治疗可以显著减少冠心病患者的不良心血管事件的发生，包括减少冠状动脉介入术后支架内再狭窄[11-13]。在本研究中，我们较早报道了阿托伐他汀对血浆microRNA-143/145表达水平的影响，研究表明，不同剂量的阿托伐他汀均可以明显上调血浆中microRNA-143/145的表达水平，而且，这个作用与阿托伐他汀降低LDL-C的作用并没有明显的相关性；同时我们还发现，血浆中microRNA-143/145的表达水平与LDL-C的水平也没有相关性。

在本研究中，我们给予稳定性心绞痛患者不同剂量的阿托伐他汀治疗，证明了该药可以提高患者血浆中microRNA-143/145的表达水平，而且中等剂量的作用更为明显，但这个作用在用药12个月随访时与1个月随访时比较，没有明显差异。虽然12个月时LDL-C由于多种原因有所反弹上升，但这并没有影响microRNA-143/145的相对高表达，而且，多个时间点的相关分析也表明，血浆microRNA-143/145水平与LDL-C的水平没有明显的相关性，提示两者之间可能没有明显的相互影响的作用。因此，我们认为，阿托伐他汀使血浆microRNA-143/145水平上调的作用是独立于其降脂作用，而这个作用可能有利于延缓冠状动脉粥样硬化斑块的进展，尤其是可能有利于减少支架内再狭窄的发生与进展，且较大剂量的阿托伐他汀可能作用更为明显。关于阿托伐他汀使血浆microRNA-143/145水平升高的机制，结合本研究结果其他相关研究，我们认为，首先，如前所述，这个作用与LDL-C水平的变化无关；其次，可能是阿托伐他汀的间接作用。曾有研究认为阿托伐他汀可以抑制平滑肌细胞增殖、诱导其凋亡[14,15]，这似乎与本研究结果矛盾。斑块成分及局部炎症对再狭窄的发生有很大影响[16]，而事实上阿托伐他汀除了降血脂，还有抗炎、改善内皮细胞功能的作用，可能正是通过这些作用间接影响到平滑肌细胞表达microRNA-143/145，将来的研究可以从细胞分子水平，进一步探讨阿托伐他汀对平滑肌细胞表达microRNA-143/145的影响，深入分析其中可能的相关分子机制。最新国内有学者研究发现阿托伐他汀可以影响冠状动脉介入治疗术患者CD4T淋巴细胞microRNA-21的表达[17]，后者在动脉粥样硬化和再狭窄过程中也起重要作用，相关研究值得进一步深入。

本研究是观察他汀类药物对血浆microRNA表达水平影响的初步研究，选取稳定性心绞痛患者，通过本研究，我们证实了阿托伐他汀可以影响冠心病病理生理过程中较为重要的microRNA的表达水平。以后的研究可以继续扩大对象范围，观察他汀药物对急性冠脉综合征患者某些microRNA表达水平的影响，并观察某些microRNA对疗效以及患者预后的影响或预测作用。

[1] Lee MS, Pessegueiro A, Zimmer R, et al. Clinical presentation of patients with in-stent restenosis in the drug-eluting stent era. J Invasive Cardiol, 2008, 20: 401-403.

[2] Alfonso F, Byrne RA, Rivero F, et al. Current Treatment of In-Stent Restenosis. J Am Coll Cardiol, 2014, 63: 2659-2673.

[3] Dangas GD, Claessen BE, Caixeta A, et al. In-stent restenosis in the drug-eluting stent era. J Am Coll Cardiol, 2010, 56: 1897-1907.

[4] Minha S, Pichard AD, Waksman R. In-stent restenosis of drug-eluting stents. Future Cardiol, 2013, 9: 721-731.

[5] O'Sullivan JF, Martin K, Caplice NM. Microribonucleic acids for prevention of plaque rupture and in-stent restenosis: "a finger in the dam". J Am Coll Cardiol, 2011, 57: 383-389.

[6] Goren Y, Kushnir M, Zafrir B, et al. Serum levels of microRNAs in patients with heart failure. Eur J Heart Fail, 2012, 14: 147-154.

[7] Rangrez AY, Massy ZA, Metzinger-Le MV, et al. miR-143 and miR-145: molecular keys to switch the phenotype of vascular smooth muscle cells. Circ Cardiovasc Genet, 2011, 4: 197-205.

[8] Elia L, Quintavalle M, Zhang J, et al. The knockout of miR-143 and -145 alters smooth muscle cell maintenance and vascular homeostasis in mice: correlates with human disease. Cell Death Differ, 2009, 16: 1590-1598.

[9] Popovich IM. The role of micro-RNA/143/145 in evolution of intrastent restenosis. Kardiologiia, 2011, 51: 17-21.

[10] Park SJ, Kang SJ, Virmani R, et al. In-stent neoatherosclerosis: a final common pathway of late stent failure. J Am Coll Cardiol, 2012, 59: 2051-2057.

[11] Nicholls SJ, Ballantyne CM, Barter PJ, et al. Effect of two intensive statin regimens on progression of coronary disease. N Engl J Med, 2011, 365: 2078-2087.

[12] Athyros VG, Kakafika A, Karagiannis A, et al. Statins and regression of coronary atherosclerosis. JAMA, 2007, 297: 2197.

[13] Gao C, Xu W, Xiao W, et al. Simvastatin decreases stent-induced instent restenosis rate via downregulating the expression of PCNA and upregulating that of p27kip1. J Interv Cardiol, 2013, 26: 384-391.

[14] Giordano A, Romano S, Monaco M, et al. Differential effect of atorvastatin and tacrolimus on proliferation of vascular smooth muscle and endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 302: H135-142.

[15] Giordano A, Romano S, Nappo G, et al. Atorvastatin sensitises vascular smooth muscle cells, but not endothelial cells, to TNF-alphainduced cell death. Curr Pharm Des, 2012, 18: 6331-6338.

[16] 罗江宾, 王天松, 方明. 斑块成份对经皮冠状动脉介入治疗术后再狭窄的影响. 中国循环杂志, 2013, 28: 176-179.

[17] 刘洋, 李浪, 苏强, 等. 强化阿托伐他汀对不稳定性心绞痛患者冠状动脉介入治疗术后CD4+T 淋巴细胞微小核糖核酸-21 表达的影响. 中国循环杂志, 2014, 29: 26-30.

Effect of Atorvastatin on Plasma MicroRNA-143/145 Expression in Patients With Stable Angina Pectoris

ZHAO Bei, LIU Li-feng, LIU Ying-qi, LIU Li, ZHAO Jing-tao, ZHOU Li, XIA Hui-hui, WANG Shou-li.
Department of Cardiology, The 306thHospital of PLA, Beijing (100101), China

WANG Shou-li, Email: wangsl.63@126.com

Objective: To investigate the effect of atorvastatin on plasma microRNA-143/145 expression in patients with stable angina pectoris (SAP).Methods: A total of 74 SAP patients taken atorvastatin at fi rst time were enrolled in this study, the patients were assigned into 2 groups by the dose of medication: Low dose group, the patients received atorvastatin 20 mg/day, n=36 and Moderate dose group, the patients received atorvastatin 40 mg/day, n=38. Plasma levels of LDL-C and microRNA-143/145 were examined before medication and at 1 month, 12 months after medication respectively. The patients were further divided into another 2 groups by plasma levels of LDL-C: Reach the standard group, plasma LDL-C＜2.60 mmol/L and Not reach the standard group, plasma LDL-C≥2.60 mmol/L. Plasma levels of microRNA-143/145 were measured and compared between 2 groups.Results:① Compared with baseline condition, plasma levels of microRNA-143/145 were increased in both groups after medication, P＜0.001 the levels in Moderate dose group were higher than those in Low dose group at both 1 month and 12 months of time points. ②Plasma levels of LDL-C were decreased with medication in both groups, P＜0.05. Micro RNA-143/145 expression was similar between Reach the standard group and Not reach the standard group, P＞0.05.Conclusion: Atorvastatin could up-regulate plasma microRNA-143/145 expression, which was not related to lipiddecreasing effect.

Atorvastatin; MicroRNA; Stable angina pectoris

2014-03-24）

（编辑：曹洪红）

100101 北京市，中国人民解放军第306医院 心血管内科

赵蓓 主治医师 博士 主要研究方向为冠心病介入诊治和心脏超声 Email: rubyzhao1212@126.com 通讯作者：王守力 Email: wangsl.63@126.com

R541

A

1000-3614（2014）12-0972-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014. 12.004

方法：入选74例首次服用阿托伐他汀的稳定性心绞痛患者，随机分为两组，低剂量组（n=36）患者每天服用阿托伐他汀20 mg，中等剂量组（n=38）每天服用阿托伐他汀40 mg。留取用药前、用药1个月及12月时的静脉血样，分别检测各份血样的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；将74例患者按照不同时间点的LDL-C是否达标分为达标组（LDL-C＜2.60 mmol/L），不达标组（LDL-C≥2.60 mmol/L）；观察各组microRNA-143/145表达水平。

结果：两组患者服用阿托伐他汀后血浆microRNA-143/145表达水平均较服用前明显升高（P＜0.001)；中等剂量组在用药1个月和用药12个月时血浆microRNA-143/145表达水平均高于低剂量组； 阿托伐他汀治疗后两组患者LDL-C均较服用前明显下降（P＜0.05)，且LDL-C达标组与不达标组的microRNA-143/145表达水平差异无统计学意义（P＞0.05)。

结论：阿托伐他汀可上调血浆microRNA-143/145表达水平，该作用与降脂无明显关系。