肝细胞生长因子在TRAIL促进原代肝星状细胞凋亡中的作用

张君红 姜海行 覃山羽 孟云超 宁 琳 杨 文 沈妍华

(广西医科大学第一附属医院老年消化内科，广西 南宁 530021)

研究表明肝纤维化的中心环节是活化的肝星状细胞(HSCs)合成大量的细胞外基质〔1〕。前期研究表明骨髓间充质干细胞旁分泌肝细胞生长因子(HGF)，能促进HSCs-T6的凋亡，可能与下调RhoA的表达有关〔2〕;而活化的HSCs系LX-2可以通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)TRAIL-R2途径凋亡〔3〕。本研究发现HSC-T6与原代HSCs的生物学特性有明显区别，因原代HSCs更接近人体的生理状态，选择原代HSCs作为研究对象对临床的应用更具有指导意义，而HGF及TRAIL在原代HSCs中的作用未见报道。本研究探讨HGF在TRAIL促进原代HSCs凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 原代HSCs由广西壮族自治区人民医院张国博士惠赠。主要试剂及仪器:HGF、TRAIL蛋白(Peprotech公司);低糖DMEM培养基(Gibco公司);兔抗鼠DR5多克隆抗体(Abcam公司);优质胎牛血清(Hyclone公司);Annexin-V-FITC/PI双染凋亡试剂盒(Biovision公司);荧光倒置相差显微镜(Zeiss公司)。

1.2 方法 原代HSCs复苏、传代与活化鉴定:从液氮灌中取出大鼠原代HSCs，37℃冻融后传代使用，于L-DMEM培养液(15%胎牛血清)、37℃，5%CO2培养箱中培养，2～3 d后80%～90%的细胞铺满瓶底即可再次传代，倒置相差显微镜下观察活体细胞形态学改变，细胞增殖明显可用于实验。

1.3 分组 ①空白对照组:单纯HSCs培养;② HGF组:单纯培养HSCs，将100 ng/ml HGF作用于 HSCs;③ TRAIL组:将2 μg/ml TRAIL作用于HSCs;④ HGF+TRAIL组:将100 ng/ml HGF预先刺激HSCs 24 h，再加入2 μg/ml的 TRAIL。各实验组细胞培养24、48 h后采用倒置相差显微镜下动态观察活体细胞形态学改变。流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测HSCs凋亡以及Western印迹法检测HSCs表面DR5蛋白的表达。

1.4 MTT法检测各浓度HGF及TRAIL对HSCs增殖抑制率①将HSCs用0.25%胰酶消化贴壁细胞，细胞计数板计数，调整细胞浓度为1.5×105/ml，吹打，混匀;② 取96孔板，每孔加入100 μl(3 000个细胞)，每时段设3个复孔，待细胞贴壁后分别加入50、100、150、200 ng/ml HGF 以及0.5、1、1.5、2 μg/ml的TRAIL蛋白，每种浓度设3个复孔。分别作用24 h及48 h，每孔加入10 μl MTT溶液，继续在37℃，5%CO2培箱中培养4 h;③置96孔板于细胞培养箱内孵育4 h后，去除培养基，加150 μl DMSO充分溶解，在Biomark酶标仪，490 nm波长下检测各孔OD值，并计算细胞抑制率。

1.5 流式细胞仪检测各组HSCs的凋亡及Western印迹法检测HSCs DR5蛋白的表达 HGF组及TRAIL组分别加入100 ng/ml HGF及2 μg/ml TRAIL 作用于 HSCs;HGF+TRAIL组中加入100 ng/ml HGF预处理24 h后再加入2 μg/ml的TRAIL，作用24、48 h后收集HSCs，使用PBS液悬混，采用 Annexin-V-FITC/PI凋亡试剂盒检测凋亡及Western印迹法检测HSCs的DR5蛋白表达，DR5浓度1∶200，其余严格按试剂说明书操作。

2 结果

2.1 HSCs的复苏、传代、形态学观察 复苏的HSCs第3天即可传代，传代的HSCs贴壁6 h后，开始伸展，胞体增大呈多边形，表现为肌成纤维母细胞的特点，伸出许多细长伪足，呈星形外观。见图1。

图1 倒置相差荧光显微镜下复苏的第四代HSCs形态

2.2 HGF及TRAIL对HSCs的增殖抑制率 HGF在50、100、150、200 ng/ml各浓度下增殖抑制率〔分别为(17.6±1.7)%、(19.1±2.5)%、(20.9±2.8)%、(18.7±2.1)%〕无明显差异(P ＞0.05);TRAIL 在0.5、1、1.5 μg/ml各浓度下对 HSCs的增殖抑制率〔分别为(4.7±0.75)%、(4.4±1.3)%、(6.2±0.78)%〕无明显差异(P＞0.05);TRAIL在2 μg/ml作用下对HSCs有抑制作用，24 h及48 h增殖抑制率〔分别为(8.03±1.2)%、(24.6±0.8)%〕有显著差异(P＜0.01)。

2.3 各组中HSCs的凋亡情况及DR5蛋白的表达 HGF+TRAIL组凋亡率明显高于空白对照组、HGF组(P＜0.05)。TRAIL组DR5蛋白明显高于空白对照组、HGF组及TRAIL组(P ＜0.01)。见表1，表2。

表1 各组各时间段凋亡率(s，%，n=3)

表1 各组各时间段凋亡率(s，%，n=3)

与空白对照组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05，下表同

时间 空白对照组 HGF组 TRAIL组 HGF+TRAIL组24 h 41.8±2.2 34.5±2.7 50.2±1.31) 58.2±2.21)48 h 44.0±1.7 49.5±1.12) 54.2±1.91) 67.0±1.41)

表2 各组各时间段DR5蛋白相对表达量(s，%，n=3)

表2 各组各时间段DR5蛋白相对表达量(s，%，n=3)

时间 空白对照组 HGF组 TRAIL组 HGF+TRAIL组24 h 0.25±0.1 0.26±0.13 0.39±0.121)0.48±0.111)48 h 0.25±0.2 0.28±0.11 0.65±0.171)0.97±0.121)

3 讨论

HSCs是位于肝窦间隙的一种非实质细胞，正常情况下HSCs处于静止状态，当肝细胞受损时其被激活，合成大量的细胞外基质(ECM)，胶原合成明显增多，HSCs的激活与增殖在肝纤维化发生过程中起关键的作用〔1〕，因此促进HSCs凋亡，减少ECM分泌及胶原的合成，是缓解肝纤维化的关键〔4，5〕。

研究表明，参与HSCs凋亡的途径主要有4条〔6〕，包括Fas-Fasl途径、神经细胞生长因子(NGF)及NGFR途径、外源性损伤途径及TRAIL-TRAILR途径。其中TRAIL-TRAILR途径占重要地位。TRAIL是TNF家族成员之一，其中包括含有死亡结构域TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)，与TRAIL结合时通过死亡结构域之间的相互识别作用与肿瘤坏死因子相关凋亡区域(FADD)结合与pro-caspase-8形成死亡诱导信号复合物，活化的caspase-8释放到胞质中启动caspase的级联反应，导致细胞凋亡。HSC-T6是一种永生细胞系，与原代HSCs在形态学、生物学特征均有不同之处。本研究表明外源性HGF在50～200 ng/ml浓度范围对HSCs的凋亡不起作用，与国外学者研究结果一致〔7〕。随着TRAIL浓度的不断增高，表现为细胞坏死。本结果说明HGF能增强TRAIL诱导的中晚期细胞凋亡，可能与主要调控中晚期凋亡的蛋白有关，HGF在对HSCs的抑制作用中不是直接的启动因素，而需介导某些中介因素发挥其作用，TRAIL可能是其中因素之一。

HGF是一种促肝细胞生长的细胞因子，其通常以单链无活性前体合成及分泌〔8〕，在HGF前体激动剂HGFA的作用下被水解成有活性的HGF双链，包括重链(α链)及无活性的轻链(β链)，活化后的HGF与受体结合引起酪氨酸激酶活化，通过激活不同信号通路产生多种生物学功能如促细胞运动、上皮细胞生长、分化及血管形成等。研究发现，HGF对于不同的细胞类型发挥着细胞保护和促进细胞死亡的双重作用〔9，10〕。HGF的表达可以活化Akt、上调Bcl-xl对Fas介导的肝细胞凋亡起保护作用〔11〕。Tulasne等〔12〕研究表明激活 HGF/c-met信号不同的下游信号分子可以抑制肝细胞的凋亡和促进HSCs凋亡的双重作用。本研究中在使用Western印迹法检测DR5蛋白的表达时发现HGF预先作用HSCs 24 h后可以上调HSCs表面DR5蛋白的表达，而DR5为TRAIL的特异性受体，其活性较DR4高103倍，在诱导HSCs凋亡的作用中占主要地位，即HGF上调DR5表达后增强了TRAIL诱导凋亡的作用，HGF可能是TRAIL及DR5的激动剂，可为TRAIL及激动剂治疗肝纤维化提供新的思路，然而体内外的环境大相径庭，加之动物实验与临床实验之间的结果相差甚远，本研究仅为临床治疗提供初步的思路。

1 Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis〔J〕.Gastroenterology，2008;134(6):1655-69.

2 陈国忠，姜海行，陆正峰，等.骨髓间充质干细胞共培养对肝星状细胞增殖、凋亡和RohA表达的调控〔J〕.世界华人消化杂志，2010;18(16):1643-9.

3 Taimr P，Higuchi H，Kocova E，et al.Activated stellate cells express the TRAIL receptor-2/death receptor-5 and undergo TRAIL-mediated apoptosis〔J〕.Hepatology，2003;37(1):87-95.

4 Friedman SL.Hepatic stellate cells:protean，multifunctional，and enigmatic cells of the liver〔J〕.Physiol Rev，2008;88(1):125-72.

5 Gressner OA，Weiskirchen R，Gressner AM.Evolving concepts of liver fibrogenesis provide new diagnostic and therapeutic options〔J〕.Comparative Hepatol，2007;6(7):112-5.

6 Shen H，Fan J，Minuk G，et al.肝星状细胞中细胞凋亡和存活的信号调控〔J〕.中南大学学报(医学版)，2007;32(5):726-34.

7 Li Y，Xing Fan，Rory C，et al.Hepatocyte growth factor enhances death receptor-induced apoptosis by up-regulating DR5〔J〕.BMC Cancer，2008;8:325-37.

8 Kataoka H，Miyata S，Uchinokura S，et al.Roles of hepatocyte growth factor(HGF)activator and HGF activator inhibitor in the pericellular activation of HGF/scatter factor〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2003;22:223-36.

9 Lee KI-I，Choi EY，Kim MK，et al.Hepatocyte growth factor promotes cell survival by phosphorylation of BAD in gastric cancer cells〔J〕.Oncol Res，2008;17(1):23-32.

10 Wang X，Zhou Y，Kim HP，et al.Hepatocyte growth factor protects against hypoxia reoxygenation-induced apoptosis in endothelial cells〔J〕.J Biol Chem，2004;279:5237-43.

11 Suzuki H，Toyoda M，Horiguchi N，et al.Hepatocyte growth factor protects against Fas-mediated liver apoptosis in transgenic mice〔J〕.Liver Int，2009;29(10):1562-8.

12 Tulasne D，Foveau B.The shadow of death on the MET tyrosine kinase receptor〔J〕.Cell Death Differ，2008;15(3):427-34.