谷氨酸介导三氧化二砷抑制SHG-44胶质瘤细胞增殖

孙桂亮 张承巍 李若文 徐海艳 崔大勇 鲁质成

(吉林大学第二医院，吉林 长春 130041)

谷氨酸(Glu)是中枢兴奋性递质，可以营养神经、促使神经元细胞的生长发育及轴突生长，但是过量可以引起细胞死亡。有研究表明(As2O3)可以诱导细胞凋亡、阻断细胞周期、降低线粒体的膜内外电位差以及增加P53蛋白的表达，达到抑制肿瘤的作用〔1～3〕。本研究针对Glu在As2O3抑制SHG-44胶质瘤细胞增殖中是否发挥作用展开研究，为As2O3抗脑内胶质瘤的作用增加实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 将SHG-44胶质瘤细胞从－80℃冰箱中取出，进行细胞复苏、传代。观察细胞在对数生长期长满后，进行台盼蓝染色排斥试验活性测定，然后用PBS缓冲液制成细胞悬液。

1.2 Glu测定 将SHG-44胶质瘤细胞配制成浓度为1×105个/ml，接种于6孔板中，加入新培养液后，放入孵箱中，5%CO2、37℃条件下孵育24 h，分别在各个孔中加入浓度分别为 0、1、2、4、8 μmol/L 的 As2O3，然后分别在加药后的 24、48、72 h使用CMA600微透析分析仪，根据微透析操作说明微量分析各组细胞液中Glu的浓度。

1.3 流式细胞技术测定氧自由基(ROS)的变化 将接种于24孔板(1 ×105/孔)的胶质瘤细胞，分别加入 0、1、2、4、8 μmol/L As2O3，在孵箱孵育24、48、72 h 后每孔加入 50 μmol/L 荧光试剂1 ml，孵箱孵育30 min。吸出含荧光试剂的培养基，胰酶消化、离心、清洗细胞。使用FACS Calibur型美国B-D公司生产的流式细胞仪，激发光488 nm，发射光525 nm，检测1×104个细胞。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0软件，采用 One-Way ANO-VA方差分析。

2 结果

2.1 不同浓度As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞后Glu浓度的变化 与未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44胶质瘤细胞相比，随作用时间的延长及作用浓度的增加，Glu浓度也逐渐增加(P ＜0.05)，见表1。

表1 不同浓度As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞后Glu浓度变化( s，μmol/L)

表1 不同浓度As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞后Glu浓度变化( s，μmol/L)

与0 μmol/L 组比较:1)P ＜0.05;下表同

As2O3(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 39.87±1.13 39.54±1.4 40.51±0.98 1 50.9±0.981) 73.68±1.451) 103.51±1.171)2 81.48±1.231) 118.47±1.451) 160.48±0.851)4 128.57±1.231) 167.88±1.391) 227.02±1.091)8 170.48±1.411) 220.4±1.261) 294.68±1.341)

2.2 不同浓度As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞后ROS的变化 As2O3作用24、48 h后1 μmol/L组与未使用As2O3组无明显差异(P＞0.05)，As2O3作用72 h后1 μmol/L组细胞内 ROS高于未使用 As2O3组(P ＜0.05);而 2、4、8 μmol/L 组，细胞染色比例随As2O3作用时间的延长及作用浓度的增加，细胞内ROS增加(P ＜0.05)，见表2。

表2 As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞DCF染色比的变化( s，%)

表2 As2O3作用于SHG-44胶质瘤细胞DCF染色比的变化( s，%)

As2O3(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 0.52±01.3 0.54±0.3 0.51±0.28 1 0.59±0.28 0.62±0.4 1.31±0.371)2 1.48±0.231) 2.91±0.381) 4.48±0.451)4 3.57±0.31) 4.82±0.411) 7.02±1.011)8 7.48±1.011) 9.45±1.061) 12.28±1.281)

3 讨论

Glu多数存在于细胞内，浓度可达细胞外的数千倍。脑脊液中的Glu通过α-酮戊二酸途径及谷氨酰胺途径生成。Glu的释放依赖于细胞膜的胱氨酸-谷氨酸交换体——Xc系统，该转运体将一分子Glu转运到到细胞外的同时，也转运一分子的胱氨酸进入细胞内，二者相互偶联进行转运。进入到细胞内的胱氨酸，在还原酶的作用下生成半胱氨酸，半胱氨酸可以:①参与谷胱甘肽(GSH)的合成，GSH为重要的自由基清除剂;②扩散出细胞后再次生成胱氨酸，参与下一次的谷氨酸-胱氨酸转运。当细胞外的Glu升高时，细胞内外Glu的浓度倒置，导致Glu转运方向转为逆向，胱氨酸进入细胞的转运被阻滞，引起细胞内GSH的合成减少〔4〕，使重要的自由基清除剂——GSH的抗氧化应激损伤能力下降，造成细胞内的ROS大量蓄积，氧自由基攻击位于细胞内的一些超微结构，特别是线粒体，出现一系列的生理生化反应，引起细胞的损伤甚至死亡。

对于胶质瘤细胞来讲，细胞外Glu的浓度升高是瘤体细胞生长以及迁移所必需的内环境〔5～7〕，而在使用As2O3后，细胞外Glu的浓度进一步升高可能是因为As2O3与线粒体膜上腺苷酸转运体结合，作用于蛋白分子中的巯基，使其空间位置上相邻的两个巯基最后形成了二硫键，导致线粒体膜PTP的开放，进而引起线粒体膜电位下降〔8〕，引起SHG-胶质瘤细胞产生内源性的ROS数量明显增多，该细胞通过增加细胞内GSH的含量来抗细胞内氧化应激带来的损伤，导致Xc系统过度转运，细胞外Glu浓度升高，而过度增多的谷氨酸，导致谷氨酸逆向转运，细胞内胱氨酸减少，GSH合成的原材料的减少以及细胞内增多的ROS引起细胞内GSH逐渐耗竭，细胞抗氧化应激的能力下降，细胞出现功能障碍甚至死亡。

由此可见，As2O3在体外抑制脑内SHG-44胶质瘤细胞的增殖来源于Glu增多，促进了细胞内GSH耗竭而引起细胞内氧化应激的加强，导致细胞的死亡。

1 Chen B，Cao F，Yuan C，et al.Arsenic speciation in saliva of acute promyelocytic leukemia patients undergoing arsenic trioxide treatment〔J〕.Anal Bioanal Chem，2013;405(6):1903-11.

2 Yanada M，Tsuzuki M，Fujita H，et al.Phase 2 study of arsenic trioxide followed by autologous hematopoietic cell transplantation for relapsed acute promyelocytic leukemia〔J〕.Blood，2013;121(16):3095-102.

3 Kim J，Aftab BT，Tang JY，et al.Itraconazole and arsenic trioxide inhibit Hedgehog pathway activation and tumor growth associated with acquired resistance to smoothened antagonists〔J〕.Cancer Cell，2013;23(1):23-34.

4 Bridges R，Lutgen V，Lobner D，et al.Thinking outside the cleft to understand synaptic activity:contribution of the cystine-glutamate antiporter(System xc-)to normal and pathological glutamatergic signaling〔J〕.Pharmacol Rev，2012;64(3):780-802.

5 Ciceroni C，Bonelli M，Mastrantoni E，et al.Type-3 metabotropic glutamate receptors regulate chemoresistance in glioma stem cells，and their levels are inversely related to survival in patients with malignant gliomas〔J〕.Cell Death Differ，2013;20(3):396-407.

6 Oh MC，Kim JM，Safaee M，et al.Overexpression of calcium-permeable glutamate receptors in glioblastoma derived brain tumor initiating cells〔J〕.PLoS One，2012;7(10):e47846.

7 Lazovic J，Soto H，Piccioni D，et al.Detection of 2-hydroxyglutaric acid in vivo by proton magnetic resonance spectroscopy in U87 glioma cells overexpressing isocitrate dehydrogenase-1 mutation〔J〕.Neurol Oncol，2012;14(12):1465-72.

8 Jia P，Chen G，Huang X，et al.Arsenic trioxide induces multiple myeloma cell apoptosis via disruption of mitochondrial transmembrane potentials and activation of caspase-3〔J〕.Chin Med J(Engl)，2001;114(1):19-24.