球形脂联素对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA的影响及机制

孟 馨 王涤非 曹艳丽 张 锦 (中国医科大学附属第一临床医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001)

糖尿病患者大血管动脉粥样硬化(AS)的发生率明显高于非糖尿病人群。研究证实高血糖所致的血管内皮功能紊乱是糖尿病大血管并发症发生和发展的关键因素〔1〕，脂联素是一种具有胰岛素增敏代谢效应和血管保护作用的脂肪细胞来源的血浆蛋白〔2，3〕。糖尿病合并心血管病变患者脂联素水平明显低于糖尿病但无心血管病变者，提示脂联素可能在糖尿病粥样硬化的发生发展中具有重要作用。Ouedraogo等〔4〕研究结果显示人脂联素的重组球形区域可降低高糖诱导的内皮活性氧自由基的产生。本研究以体外培养的人脐静脉内皮细胞为模型，探讨球形脂联素(gAd)对高糖诱导血管内皮细胞巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)mRNA表达的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 gAdAPN、D-葡萄糖、cAMP/PKA抑制剂 H-89(美国Sigma公司);RPMI1640细胞培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);Trizol逆转录试剂盒试剂购自美国Gibco公司;MIP-1α引物由上海生物工程有限公司合成;DNA marker购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 PBS冲洗新生儿脐带静脉腔，0.25%的胰蛋白酶后收集内皮细胞悬液，离心后用150 mg/L内皮细胞生长添加物、75 μmol/L肝素、20%胎牛血清的RPMI1640培养液吹打接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱内培养，融合后予0.125%的胰蛋白酶、0.02%EDTA消化传代，第2～3代用于实验。细胞经Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色鉴定。

1.3 实验分组 待细胞生长至亚融合状态时，改用无血清培养液继续培养12 h，PBS洗涤细胞3次，进行下列分组处理:(1)用含不同浓度(5.6、11.1及22 mmol/L)葡萄糖的培养液对内皮细胞体外培养6 h;(2)gAd 100 nmol/L作用30 min后再加入22 mmol/L葡萄糖作用内皮细胞6 h;(3)H-89 1 μmol/L预处理15 min，予gAd 100 nmol/L作用30 min后再加入22 mmol/L葡萄糖作用内皮细胞6 h;(4)予以相同浓度及作用时间甘露醇作为对照组。每组实验重复3次。

1.4 RT-PCR检测内皮细胞内MIP-1α mRNA的表达 用Trizol试剂提取各组细胞总RNA。取各组细胞总RNA各1 μg逆转录成 cDNA，再取 2 μl cDNA进行 PCR循环，94℃ 变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35 个循环，末次延伸72℃10 min，4℃ 储存。MIP-1α 引物序列为:正链5'-CTGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG-3'，负 链 5'-CTGCCGGCTTCGCTTGGTTA-3'，PCR扩增产物长度为197 bp;β-actin引物序列为:正链 5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'， 负 链 5'-CATCTCTTGGTCGAAGTCCA-3'，扩增产物长度为 308 bp。反应产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳分离，应用凝胶成像系统(美国αinnotach公司IS5500型)分析软件测定条带吸光度值，计算MIP-1α/β-actin积分吸光度比值。

1.5 统计学分析 采用SPSS11.0进行统计学分析，所有数据均以s表示，组间差异显著性比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 高糖对血管内皮细胞表达MIP-1α mRNA表达的影响人脐静脉内皮细胞在倒置显微镜下呈铺路石状贴壁生长，予不同浓度葡萄糖处理内皮细胞后，用RT-PCR检测MIP-1α mRNA表达水平。电泳结果显示，葡萄糖浓度在5.6～22 mmol/L范围内，MIP-1α mRNA的表达随葡萄糖浓度的增高而明显增加，22 mmol/L葡萄糖处理后内皮细胞MIP-1α mRNA的表达最高，且呈剂量依赖方式(P＜0.05);平均积分光密度值分析显示，各组内皮细胞内MIP-1α mRNA的表达量分别为5.6 mmol/L葡萄糖组的1.87倍及2.64倍。见图1。

2.2 gAd对高糖诱导的血管内皮细胞表达MIP-1α mRNA表达的影响 100 nmol/L gAd干预内皮细胞后，内皮细胞MIP-1α mRNA的表达下降，平均积分光密度值分析显示MIP-1α mRNA的表达量降至5.6 mmol/L葡萄糖组的1.96倍;cAMP/PKA抑制剂H-89部分阻断了gAd对高糖诱导的血管内皮细胞MIP-1α mRNA产生的抑制，平均积分光密度值分析显示 MIP-1α mRNA的表达增加为5.6 mmol/L葡萄糖组的2.35倍(P＜0.05)。见图1。

图1 各组内皮细胞内MIP-1α mRNA的表达

3 讨论

血管内皮细胞的结构和功能紊乱是AS的始动因素。MIP-1α，一种属于趋化因子CC亚家族的单核细胞/巨噬细胞趋化因子，可由血管内皮细胞、平滑肌细胞及单核细胞等产生。研究表明，MIP-1α可显著增加单核细胞黏附于血管内皮细胞，在单核细胞黏附于血管壁进而侵入内膜下间隙转变为巨噬细胞吞噬脂质中起着重要作用〔5〕。糖尿病大血管并发症的病理改变是动脉粥样硬化，但与非糖尿病患者相比致残率和致死率明显增高，严重影响患者的生存质量和寿命。我们前期研究显示，高血糖以时间及剂量依赖方式促进血管内皮细胞表达MIP-1α〔6〕，从而参与糖尿病 AS 的形成。

近几年脂肪组织因其具有的内分泌功能而受到广泛关注，而作为脂肪细胞因子之一的脂联素成为了内分泌领域研究的热点。1995年Scherer等〔7〕首先发现脂肪细胞分泌的一种类似于补体成分C1q的一种分泌型血浆蛋白质。脂联素结构包含有4个结构域:氨基端的信号序列、可变区、胶原样区、羧基端球状区，其中gAd是脂联素主要的功能结构域，比全长脂联素具有更强的生物学作用。体外研究发现，生理浓度的脂联素通过激活cAMP依赖的蛋白激酶A剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的单核细胞对内皮细胞的黏附及NF-κB的活化，从而阻断内皮细胞的炎性过程。这些结果表明，脂联素可能通过cAMP/PKA和NF-κB通路调节内皮细胞的炎症信号的转导。此外，脂联素尚可通过抑制A型清道夫受体的表达，降低oxLDL的摄入，抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化〔8〕。由此可以推测，脂联素可通过抑制慢性炎症反应而保护血管内皮细胞功能。

目前有关脂联素对葡萄糖浓度诱导内皮细胞表达MIP-1α影响的研究鲜有报道。本研究中我们发现，在一定葡萄糖浓度范围内，随葡萄糖浓度的增高，葡萄糖以剂量依赖方式促进血管内皮细胞MIP-1α mRNA的表达;gAd显著减轻了对高糖诱导的血管内皮细胞MIP-1α mRNA的产生;cAMP/PKA抑制剂H-89部分阻断了gAd对高糖诱导的血管内皮细胞MIP-1α mRNA产生的抑制。我们的研究表明，gAd可能通过抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞MIP-1α的表达，从而下调单核细胞向内皮细胞的趋化黏附，其中涉及的信号转导通路部分经由cAMP/PKA途径，为糖尿病大血管并发症的深入研究提供新的理论依据，也为临床上治疗糖尿病AS的防治提供了新的思路和药物治疗靶点。

1 The DCCT/EDIC Study Research Group.Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes〔J〕.N Engl J Med，2005;353(25):2643-53.

2 Goldstein BJ，Scalia R.Adiponectin:a novel adipokine linking adipocytes and vascular function〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(6):2563-8.

3 Hug C，Lodish HF.The role of the adipocyte hormone adiponectin in cardiovascular disease〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2005;5(2):129-34.

4 Ouedraogo R，Wu XD，Xu SQ，et al.Adiponectin suppression of high-glucose-induced reactive oxygen species in vascular endothelial cells〔J〕.Diabetes，2006;55(6):1840-6.

5 Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease〔J〕.N Engl J Med，1999;340(2):115-26.

6 孟 馨，张 锦，滕 颖，等.葡萄糖浓度对血管内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA及蛋白的影响〔J〕.中国医科大学学报，2004;33(6):514-6.

7 Scherer PE，Williams S，Fogliano M，et al.A novel serum protein similar to C1q produced exclusively in adipocytes〔J〕.J Biol Chem，1995;270(45):26746-9.

8 Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al.Adipocyte-derived plasma protein，adiponectin，suppresses lipid accumulation and class.A scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages〔J〕.Circulation，2001;103(8):1057-63.