改良型磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型的构建

刘 铭 张 健 魏小兰 陈婷梅 刘庆芸

(安康职业技术学院附属医院，陕西 安康 725000)

人工关节置换术已经有100多年的历史，是治疗严重关节疾患、重塑关节功能的重要手段，是广大关节患者的福音。然而，随着关节置换例数的增多，假体晚期无菌松动的问题日趋严重，二次翻新治疗给广大患者无论是经济还是精神上带来严重的创伤〔1〕。因此，任何有效的通过非手术方式来预防和治疗人工关节无菌松动这一晚期并发症一直是关节外科的研究热点。目前研究发现，导致无菌性关节松动主要原因是磨损颗粒诱导假体周围骨溶解〔2〕。本次实验采用盐结晶携带聚乙烯磨损颗粒置入部分去除小鼠颅骨外膜的颅顶处，建立骨溶解模型，探讨其可行性，从而为人工关节松动的研究提供简单、快捷、经济、方便、实用性强的实验学基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料 实验选用近交系雌性BALB/c小鼠30只，8～10周龄，体质量约20 g，由重庆医科大学实验动物中心提供;聚乙烯微粒购于美国 Zimmer公司，微粒直径为2～3 μm，用70%乙醇溶液反复冲洗颗粒，并浸泡24 h后用生理盐水洗去酒精，制成生理盐水的悬浮液，浓度为10 mg/ml;TRAP试剂盒购于南京建成公司;电镜日立-S-3000N，切片机德国LEICARM2135，OLYMPAS BX-50多功能显微镜。

1.2 方法

1.2.1 盐结晶携带聚乙烯磨损颗粒磨的制备 5%生理盐水2 ml和20 mg高分子聚乙烯颗粒充分混合，制成10 mg/ml浓度的盐溶液。在常温无菌环境下(超净台)自然蒸发5～7 d，盐溶液结晶。捣碎后制成盐包埋磨损颗粒结晶体，在电子秤上分别称出10包盐(51 mg/包)包埋聚乙烯磨损颗粒和纯盐晶体待置。

1.2.2 体内小鼠颅骨骨吸收模型的制作 30只清洁无菌小鼠，随机分成三组，每组10只，生理盐水组(A组)、纯盐组(B组)，C组，称重并标记。制备4%水合氯醛，按照1 ml/100 g体重进行腹腔麻醉，麻醉成功后，小鼠头部用脱毛剂给予充分脱毛，干净后碘伏常规消毒，铺一次性无菌巾，在小鼠颅顶矢状线(垂直于小鼠双侧外耳道连线，并经过此连线的中点)用15号小圆刀或者小剪刀切开1 cm左右皮肤及皮下组织。在助手成功对小鼠头部皮肤牵引下，充分暴露小鼠颅顶1 cm2左右范围完整骨膜。在颅顶处，用小圆刀轻轻剥离或者15号小镊子轻轻撕脱小鼠颅骨外膜，形成0.2～0.2 cm骨膜缺损区(一般无出血，有少量出血时，用无菌纱布轻拭即可)。其中A组用消毒微量取样枪吸取50 μl 5%生理盐水滴入骨膜缺损区即可;B组放入无菌盐颗粒51 mg即可，C组放入51 mg盐包埋磨损颗粒结晶体，对于C组和B组在放置盐结晶物或者纯盐颗粒时，应尽量均匀放置在骨膜缺损区。然后用无菌、无损伤线缝合伤口。在整个手术过程中，小鼠眼睛用无菌红霉素眼膏保护。模型构建成功后，待小鼠麻醉清醒后分笼饲养。术后常规给予青霉素抗炎2 d，预防感染。术后14 d分别处死各组小鼠，无菌环境下取颅骨顶处骨组织(此项操作中要求取出的颅顶骨以正中矢状线为中心的环形区域)，取出标本用 PBS液冲洗，10%中性甲醛固定24 h，10%中性EDTA脱钙液脱钙14 d后蒸馏水冲洗70%酒精固定、石蜡包埋，切片机切片，连续三层切片，层厚6 μm(备用HE、TRAP染色)。对于送电镜处取材小鼠，标本用生理盐水冲洗3遍，4%戊二醛固定送入电镜室专业处理。

1.2.3 骨溶解的观察及计算 选定切片，行常规HE染色，在10×、20×及40×条件下观察颅顶骨膜炎性反应和颅骨的表面侵蚀情况，以及骨组织细胞数量分布，每组选用3个标本进行观察，每个标本采集5个不同的视野，采用Image ProPlus 6.0(IPP)图像分析软件测量正中矢状线区域骨吸收溶解面积，并对骨外膜炎性反应细胞及骨组织内细胞计数。TRAP染色是破骨细胞的特异性染色。将切片按照TRAP试剂盒说明书进行染色，着色后破骨样细胞呈棕红色。Olympus电子显微镜20×、40×及100×条件下观察，100×条件下摄像计算正中矢状线区域的TRAP+细胞数量。

1.2.4 骨片扫描电镜检查 小鼠深麻醉后，快速取出新鲜小鼠颅骨标本用生理盐水冲洗3遍，4%戊二醛固定2 h以上，再用OsO4固定1 h，生理盐水冲洗3遍，单宁酸固定2 h以上，生理盐水冲洗3遍，依次10%、30%、50%、70%、90%、100%酒精分别脱水15 min，再在30%、50%、70%、90%、100%叔丁醇中分别浸泡15 min以保护骨组织，4℃冰箱放置24 h后，放入液氮冷冻，干燥后真空喷吐金粉，在日立-S-3000N扫描电镜下检查小鼠颅骨表面的骨质吸收情况采用IPP图像分析软件对各组吸收陷窝面积进行计算分析，统计各组3个标本，每个标本在500～3 000倍视野下取5个不同视野进行陷窝面积计算，取平均值，计算其占视野面积的百分数。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.5统计软件包进行单因素方差分析，数据均以s表示。

2 结果

2.1 HE染色结果 A组和B组骨表面溶解面积和骨内细胞数量统计结果无明显差别，但B组骨膜炎性反应细胞略增高，无明显统计学意义(P＞0.05);加入盐包埋磨损颗粒结晶体混合物无论骨溶解面积还是骨膜反应以及骨组织内骨细胞明显增多(见图1);小鼠颅顶骨膜反应细胞渗出数结果 (个/视野):A组(1 540±368)、B组(1 610 ± 535)、C组(3 478±376)。骨组织内骨细胞数量(个/视野)A组(10±3)、B组(12±2)、C组(25±5)(这点与TRAP染色结果较为一致)。A组和B组骨表面溶解面积和骨内细胞数量统计结果无明显差别，但B组骨膜炎性反应细胞略增高，但无明显统计学意义(P＞0.05);加入盐包埋磨损颗粒结晶体混合物后骨溶解面积、骨膜炎性反应细胞以及骨组织内骨细胞明显增多(P＜0.01)。

2.2 TRAP染色结果 A组和B组未见明显染色区域，仅有少许红色区域，细胞数量少;C组颗粒组染色深，阳性染色面积区域大，细胞数量明显增多，并可见较明显骨吸收的情况。TRAP染色阳性细胞计数结果(个/视野):A组为(3.842 7±1.182 1)、B组为(4.026 1±1.37 2)、C组(17.325± 4.210 7)。A组与B组相比无明显差别(P＞0.05);C组与A和B组比较:破骨细胞数量明显增加，溶骨效应增强，差异显著(P＜0.01)。见图1。

2.3 小鼠颅骨电镜扫描检查 见图2。A组和B组:骨纤维组织结构紧密，钙丢失较少，未见明显吸收陷窝;C组:陷窝形态多样以圆形、椭圆形多见，同时可见腊肠型复合不规则性，骨吸收区凹陷形成岩溶现象;陷窝深浅不一，有些深的陷窝边界清晰、底面粗糙、在陷窝中央可见片絮状东西黏附，周围及底部可见纤维纹路;有些陷窝较浅，仅有斑点状骨质吸收区域，骨片表面粗糙、钙丢失明显，骨质疏松严重。IPP图像软件分析骨吸收区域与视野面积的百分比结果:A组(3.09±0.62)%、B组(3.25±0.78)%、C组(14.58±2.68)%，C组与A组、B组比较差异显著(P＜0.05)。

图1 各组小鼠颅骨组织病理图片(×200)

图2 各组小鼠颅骨组织电镜观察结果(SM，×200)

3 讨论

面对日益增多关节关节置换、返修患者，我们亟待解决假体关节无菌关节松动这一难题。为此，我们需要建立一种简单、经济、真实、可操作性强的模拟的动物实验模型作为基础实验平台。

目前国内外在建立体外假体无菌松动急性骨溶解病理模型中，多采用小鼠背部皮下气囊植骨模型〔3，4〕，该实验模造模简单、节约时间、易操作;模拟性强;实用性及敏感性好;其较强的气囊壁炎性反应，能够方便检测磨损颗粒诱导各类炎性因子，进行细胞因子分析。但是，该实验最大缺点是没有骨组织的参与〔5〕，缺少血供、神经营养支持不能真实模拟磨损颗粒在体内诱导溶骨的真实环境，亦不能真实反映骨组织在重建中成骨细胞的修复和破骨细胞的溶骨的动态平衡〔6〕。同样，对于溶骨现象，这种动物模型也无法考虑骨自身的修复作用，因此不能准确做出溶骨定量测定。

在磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型中，国内外多采用两种方法:(1)皮肤缝合包埋法:这种方法在小鼠颅骨外膜外放置大量磨损颗粒后，皮肤缝合后完成。这种方法可行性强，也符合磨损颗粒诱导破骨细胞溶解骨组织致假体松动体内环境模拟。但这种实验模拟需要大量磨损颗粒〔7〕，由于磨损颗粒价格高昂，需要大量实验资金投入。同时，大量磨损颗粒在颅骨外膜蓄积，骨外膜及皮肤、皮下组织炎性反应强处，溶骨时间较短，不利于实验进行及观察。此外，由于小鼠颅骨皮肤及皮下组织与颅骨外膜组织疏松，在小鼠清醒活动时，大量磨损颗粒必然会沿着疏松的组织间隙向颅骨外膜周围蔓延，甚至进入小鼠眼眶、上唇、颈部周围，造成多处周围组织损伤和粘连，取材组织易遭破坏，影响实验结果。(2)磨损颗粒悬浮液颅骨外膜膜下注射法〔8，9〕:该法用微量注射器在颅骨表面注入颗粒悬液并均匀分布于骨表面。该法优点是需要磨损颗粒少，操作方便。但是由于高分子聚乙烯磨损颗粒密度低，很难配制均匀磨损颗粒混合液，取等量标准液时磨损颗粒量不均等，影响实验结果观察;另外，小鼠骨外膜组织特薄、疏松，注射液体时很易撑破骨外膜，并从进针口和撑破处溢出，实际留置在骨表面的颗粒悬浮液较少，因此不能产生很好溶骨效应;其次，小鼠颅骨板很薄，进针容易误入颅内，造成小鼠脑组织损伤甚至死亡。

“盐溶法”在进行本次小鼠颅骨溶解模型中建立中，首先在磨损颗粒(直径为2～3 μm)〔10〕符合诱导溶骨条件的基础上，利用盐水和磨损颗粒混合后，自然条件下蒸发，得到盐、磨损颗粒结晶体混合物，并把这种盐混合结晶体放置在去部分颅骨外膜的颅顶处。由于盐晶体的理化特性决定其溶解时和颅骨黏附较为紧密，在盐溶解过程中逐渐把适量的磨损颗粒释放出来，较为均匀地分布在颅骨外，达到直接放置磨损颗粒的目的;另外，在盐晶体溶解过程中，周围颅骨外膜会迅速长入，很快把磨损颗粒完全包埋在骨膜下，不会出现磨损颗粒向周围蔓延现象。次外，由于盐溶解周围的高渗状态，不利于细菌的生长，便于伤口修复。该实验优点是需要磨损颗粒少、花费少、不易浪费、易操作，并且把颗粒直接和骨面接触，更符合假体松动体内骨溶解环境。但是和上述构建模型一样，此种模型没有假体的植入，仍然属于急性溶骨病理模型范畴。因此在研究松动的过程中并没有考虑机械应力对松动的影响，这与人工关节松动发生的慢性溶骨过程是有差别的〔11〕。另外，在放入盐磨损颗粒混合物时对小鼠伤口有部分痛刺激作用，因此要求对小鼠麻醉程度要求较高。总之，本实验在磨损颗粒符合诱导溶骨条件的基础上，通过HE、电镜扫描、TRAP染色来观察、分析骨膜炎性细胞渗出、骨破坏面积及破骨细胞数目变化表明小鼠颅骨发生了明显的骨溶解、吸收现象，与人体内磨损颗粒诱导的骨溶解吸收表现非常相似。从总体而言，该实验模型的设计克服了上述各模型的不足，更加简洁方便、易操作，过程严谨可靠，结果合理有效，可信度高，值得推广的一种基础实验方法。

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