嗜酸乳杆菌和双歧杆菌遗传性对其益生特性及货架期菌数的影响

徐显睿，李翠凤，张宗博，谢璐璐，刘国强，李敏，赵林水，张兰威

（1.杭州娃哈哈科技有限公司，杭州310018；2.青岛根源生物技术集团食品实验室，山东 青岛266000；3.中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东青岛266000）

0 引言

益生菌除调节肠道健康[1-3]和提高免疫力[4-6]外，还可缓解儿童轮状病毒、抗生素相关腹泻[7-8]、便秘[9]，改善骨质疏松[10]、焦虑抑郁[11]、过敏性鼻炎[12]，降低血糖[13]，控制体重[14]，抑制炎症等[15]，并且有研究表明对益生菌功效研究主要集中在嗜酸乳杆菌和双歧杆菌[16]，益生菌在产业化和生产流通中，需能保证有效菌数，较好稳定性，并保持活性和益生特性[17]，但在生产中存在菌株衰退导致生物学性状发生改变[18]，且产业化后菌株功效验证往往复杂和严格，因此将菌株能否保持筛选时益生特性及遗传稳定性作为可实现产业化的首要条件和标准[19]。这是因为连续传代和转管次数可导致基因重排或缺失，影响其益生特性[20-23]。

本研究中菌株是经文献报道，具有优良益生特性[24]。通过评价益生性状遗传性及货架期存活率，筛选益生特性最佳菌株，旨在为益生菌产品产业化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-1，Z-36，Z-38，Z-39，长双歧杆菌Z-5，短双歧杆菌Z-47，由青岛根源生物技术集团公司食品菌株资源库提供；鼠李糖乳杆菌LGG购于新西兰恒天然公司。

MRS肉汤培养基（青岛海博生物技术公司）；浓盐酸、NaCl、NaOH、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、氯仿、L-半胱氨酸盐酸盐（均为分析纯），上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

立式高压蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50SⅡ型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；厌氧培养罐AG050型，广州雷得生物技术有限公司；电子天平SE6001FZH，美国奥豪斯公司；1-7离心机，德国Sigma公司；p H计PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；紫外可见分光光度计756PC型，上海光谱仪器有限公司；生化培养箱LRH-250型，上海一恒科学仪器有限公司；旋涡振荡器MX-S型，美国赛洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株连续传代

将供试菌株原始保藏菌种划线于固体MRS培养基上，复壮2代，37℃恒温培养48 h，根据菌落形态选取3个单菌落分别接种于MRS液体培养基中（双歧杆菌添加L-半胱氨酸盐酸盐），37℃恒温培养16 h，作为连续传代的初始菌株。为保证菌株遗传稳定，选择稳定期进行菌株连续传代，上述菌株培养12 h均处于稳定期，因此以12 h为1个传代周期，连续传代6次，获得传代菌液，备用。

1.3.2 菌体制备

按1.3.1中方法获得不同菌株传代4，5，6次菌液；4℃，8 000g条离心10 min，收集菌体。用p H值为6.8无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2次，再用4～8 mL无菌PBS将菌体重悬，备用。

1.3.3 菌株耐模拟胃酸和肠液能力测定

按1.3.1中方法获得传代4，5，6次菌液；在4℃，4 000g条件下离心10 min收集菌体，用无菌水洗涤2次，等体积重悬于人工胃液或肠液，在模拟胃液中孵育15，30，60 min（在人工肠液中孵育5 h），取重悬液稀释后倾注于MRS琼脂培养基平板，37℃培养48 h进行活菌计数，以鼠李糖乳杆菌LGG作为对照，分别计算连续传代4、5、6代各菌株存活率，存活率为

式中：B0为菌悬液初始菌数；B1为人工胃液或肠液处理后菌悬液菌数。

1.3.4 菌株静电作用率测定

以氯仿为路易斯酸，用p H值为6.8的PBS将

1.3.2 中菌悬液OD600调至0.6，加入1 mL氯仿，静置5 min后充分震荡120 s，再静置10 min取水相，以鼠李糖乳杆菌LGG为对照，用石英比色杯测定OD600nm，疏水率为：

式中：OD0为菌悬液初始OD600nm；OD1为静置10 min后水相OD600nm。

1.3.5 菌株自凝集率测定

用p H值为6.8的PBS将1.3.2中菌悬液OD600调至0.6，于37℃静止放置2 h。以鼠李糖乳杆菌LGG作为对照，测定上层液体OD600nm，自凝集率为

式中：OD0为菌悬液初始OD600nm；OD1为静置后菌悬液上层液体OD600nm。

1.3.6 菌粉货架期活菌数测定

按1.3.1中方法将不同菌株传代4，5，6次菌液制成菌粉，取1 g稀释菌粉装于双层铝箔袋中，密封，放置于25和-20℃条件下保存，分别于0，15，30，45，60，75，90 d取样测定活菌数。

1.3.7 活菌数测定参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定。

1.4 数据处理

采用OriginPro 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同代数耐模拟胃液测定结果

由图1可知，不同菌株传代4次对模拟胃液耐受性不同，嗜酸乳杆菌Z-43、长双歧杆菌Z-5、短双歧杆菌Z-47对模拟胃液耐受性最差，孵育15 min无活菌存活。乳双歧杆菌Z-1对模拟胃液耐受性最好，在模拟胃液中孵育60 min的存活率高达93.07%，其次为乳双歧杆菌Z-36和Z-38，在模拟胃液中孵育60 min的存活率分别为65.66%和22.64%。乳双歧杆菌Z-39在模拟胃液中孵育30 min存活率为58.79%，对模拟胃液耐受性一般，但较对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG均表现出更好的胃酸耐受能力。

图1菌株传代4次对模拟胃液耐受性

由图2和图3看出，相对于4次传代，菌株经5，6次传代对模拟胃液耐受性均呈下降趋势，且孵育时间越长，对模拟胃液耐受性越差。乳双歧杆菌Z-1传代5次在模拟胃液中孵育15，30，60 min较4次传代；耐受性分别降低31.56%，26.74%，56.27%；但与传代6次在模拟胃液中孵育15，30，60 min存活率基本一致，分别为70.36%，68.26%，36.8%和68.16%，67.77%，41.76%。乳双歧杆菌Z-36和Z-38连续传代对模拟胃液耐受性变化趋势与乳双歧杆菌Z-1类似，传代5和6次对模拟胃液耐受性变化不显著，较4次传代耐不同时间模拟胃液能力分别降低约16.14%，44.77%，37.42%和23.9%，7.59%，18.14%。乳双歧杆菌Z-39连续传代对模拟胃液中孵育15 min的存活率无影响，孵育30 min存活率由58.79%降低至2.68%。对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG经连续传代对模拟胃液耐受性由19.83%降低至11.2%，变化趋势不显著，可能与鼠李糖乳杆菌LGG具有相对稳定的遗传特性有关，也可能因为菌株本身耐模拟胃液的能力较差。因此综上所述，4次传代的乳双歧杆菌Z-1表现为最佳耐胃酸菌株。

图2菌株传代5次对模拟胃液耐受性

图3菌株传代6次对模拟胃液耐受性

2.2 不同代数耐模拟肠液测定结果

由图4可知，菌株传代不同次数对模拟肠液的耐受性不同。嗜酸乳杆菌Z-43、乳双歧杆菌Z-38和Z-39传代4，5，6次对模拟肠液耐受能力基本一致，甚至有上升趋势。其中乳双歧杆菌Z-39传代6次对模拟肠液耐受性为96.94%，提高约20%。嗜酸乳杆菌Z-43传代5，6次耐模拟肠液能力较传代4次提高8.83%和5.24%，分别为40.56%和36.97%。对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG经连续传代提高约1.99%，上述菌株在该特性方面表现出较好的遗传稳定性。乳双歧杆菌Z-1，Z-36，长双歧杆菌Z-5，短双歧杆菌Z-47连续传代对模拟肠液耐受性呈逐渐降低的趋势，降低18.34%~36.57%。因此综上所述，传代4，5，6次对嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-38和Z-39耐模拟肠液能力无影响，而其他菌株传代4次则表现为菌株自身最佳耐肠液能力。

图4菌株传代不同次数对模拟肠液耐受性

2.3 不同代数静电作用率测定结果

乳酸菌在肠道中以特异性和非特异性两种方式黏附于小肠黏膜，非特异性作用方式主要与静电作用率有关[25]。由图5可知，菌株传代不同次数对菌株表面携带产生静电作用的电荷量不同。嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-1，Z-36，Z-38，对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG传代4，5，6次对氯仿的静电作用率差异不显著，差异在0.77%~9.74%；乳双歧杆菌Z-39，长双歧杆菌Z-5，短双歧杆菌Z-47随传代次数增加，静电作用率逐渐减弱，其中乳双歧杆菌Z-39经6次传代，其对氯仿静电作用率降低最大，约34.12%。因此综上所述，嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-1，Z-36，Z-38连续传代6次静电作用率基本相同，其他菌株传代4代静电作用率最大。

图5菌株传代不同次数静电作用率测定结果

2.4 不同代数自凝集率测定结果

乳酸菌的高自聚率有利于其在小肠黏膜上定植[26]。由图6可知，菌株传代不同次数自凝集率不同。嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-1，Z-36，短双歧杆菌Z-47连续传代6次自凝集率基本一致；其中菌株Z-1，Z-36，Z-47自凝集率有0.64%~4.23%提高，它们与对照菌株鼠李糖乳杆菌LGG在自凝集率方面均表现出较好的稳定遗传能力，其他菌株传代6次自凝集率较4代传代则降低4.71%~10.55%。

图6菌株传代不同次数自凝集率测定结果

2.5 不同代数、温度货架期菌数测定结果

由图7可知，菌株传代不同次数制备菌粉在25℃（90 d）货架期菌数存活率不同，嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-1，Z-36在货架期菌数存活率及遗传稳定性方面表现最好。嗜酸乳杆菌Z-43传代4次在15，30，45，60，75，90 d菌 数 存 活 率 分 别 为80.34%，71.88%，66.86%，66.29%，69.38%，57.43%；与传代5，6次菌数存活率变化曲线一致。传代5次在90 d菌数存活率为55.92%，较4次传代有较好遗传稳定性，连续传代6次在90 d菌数存活率为41.84%，降低约14.84%，差异不显著。乳双歧杆菌Z-1和Z-36传代4，5，6次货架期菌数变化趋势基本相同，且遗传稳定性均较好；在15，30，45，60，75，90 d菌 数 存 活 率 分 别 为91.54%~107.88%，79.45%~84.27%，50.77%~66%，39.33%~56.79%，30.31%~40.86%，25.82%~30.10%和88.81%~95%，73.23%~76.74%，47.75%~54.67%，35.6%~36.86%，27.30%~28.72%，22.5%~24.11%。

图7 25℃菌粉货架期活菌数测定结果

长双歧杆菌Z-5货架期菌数存活率遗传稳定性较好，但货架期菌数稳定性较上述菌株偏低，15 d存活率仅为37.27%，但90 d存活率约为23.16%，说明该菌株在前期衰减速度较快，而在后期相对稳定，这种变化趋势与短双歧杆菌Z-47相类似。其他菌株随着连续传代货架期菌数存活率呈明显下降趋势，如乳双歧杆菌Z-38传代6次在45 d存活率较4次传代下降约19%（60 d）下降约12.95%。其中乳双歧杆菌Z-39货架期菌数及遗传稳定性最差，传代6次在90 d存活率显著减低，仅为0.37%。

图8-20℃菌粉货架期活菌数测定结果

由图7和图8可以看出，菌株传代不同次数制备菌粉在-20℃（90 d）货架期菌数存活率较25℃条件下显著提高，并且稳定性更好，此外菌株连续传代表现的遗传稳定性也更好。嗜酸乳杆菌Z-43，乳双歧杆菌Z-1，Z-36经连续传代在90 d菌数存活率均在90%以上；其他菌株经连续传代各代间菌数存活率基本一致，在-20℃（90 d）存活率在40%左右。其中短双歧杆菌Z-47传代6次在90 d菌数存活率为23.4%，较传代4，5次降低约10%。因此综上所述，以菌数稳定性指标考虑，嗜酸乳杆菌Z-43，短双歧杆菌Z-47传代5次，长双歧杆菌Z-5，乳双歧杆菌Z-1和Z-36传代4，5，6次其货架期稳定性最好；而乳双歧杆菌Z-38，Z-39传代4次为最佳。另外在产业化中将菌粉用载体稀释并采用充氮包装形式可改善菌粉货架期稳定性[21,27]。

3 结论

对嗜酸乳杆菌和双歧杆菌进行连续传代，分别测试传代4、5、6次菌株对模拟胃液和肠液的耐受性，并以静电作用率和自凝集率指标评价不同代数菌株黏附性，再分别考察菌株传代不同代数制成菌粉在25、-20℃条件下保藏90 d的菌粉稳定性。结果表明嗜酸乳杆菌Z-43连续6次传代其静电作用率约为100%，在25和-20℃条件下90 d菌数存活率稳定在60%和90%以上，具有极好遗传稳定性，黏附性和货架期稳定性。其中乳双歧杆菌Z-1传代4次在模拟胃液、模拟肠液中分别孵育60 min和5 h的存活率为93.07%和106.5%，对氯仿静电作用率为97.35%，表明其肠道定植能力较好。在25和-20℃条件下90 d菌数存活率分别为30.10%和92%，稳定性较好，表现为最佳抗性菌株。因此在后续菌粉产业化中，需对嗜酸乳杆菌Z-43冻干保护剂和产品剂型重点研究，提高菌剂对胃酸的耐受性。对于乳双歧杆菌Z-1则需重点关注菌种保藏、活化次数，防止其益生性状衰退。