细菌纤维素酸乳制备工艺及稳定性能

张 雯, 王建军, 房茹茹, 党苗苗

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

酸乳具有调节人体肠道中微生物菌群平衡、促进钙、镁、单糖等吸收、控制体内毒素、改善肝功能等作用，同时以其独特的营养和风味风靡全世界[1].但制备过程中脂肪上浮和蛋白质沉淀问题一直制约着其产品开发和生产[2]，目前已成为酸乳制备工艺的研究热点，将膳食纤维作为稳定剂加入其中是解决方案之一，国内外已经做了一些研究.

细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)是由微生物合成的、由吡喃葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，呈现独特的三维网状结构[3].作为膳食纤维，BC可改善糖代谢，对糖尿病患者血糖控制具有积极作用[4]；对高脂肪膳食引起的肝脂肪病变有阻抑作用[5]，能够起到预防脂肪肝的作用；BC独特的三维网状结构使其具有增稠、乳化等作用，影响食品分子结构、胶凝和粗度，可作为稳定剂部分替代酸乳中外源添加的稳定剂，减少食品添加剂的使用，降低成本.

将BC与酸乳结合制备新型膳食纤维酸乳，有望改善酸乳脂肪上浮和蛋白质沉淀的问题，同时使酸乳产品进一步功能化.该类产品的开发可丰富酸乳市场产品类型，促进BC在食品行业的应用.文献[6-16]从不同方面报道了果胶作为复配剂或单独使用对乳体系相分离及稳定性的影响研究，为不同食品添加剂在酸奶中的应用提供一定的理论支持和技术参考.田芬等[17]表明水溶性膳食纤维能够增大体系的粘度和粒度.Jagannath等[18]表明BC或Nata可以为乳酸菌发酵过程提供支持.

本文以新鲜生牛乳为原料，添加BC制备新型膳食纤维酸乳，旨在改善酸乳产品蛋白质沉淀的问题.研究了BC酸乳发酵过程中发酵乳含量、BC添加量、复配稳定剂种类及含量等因素对BC酸乳的影响及环境应力对BC酸乳稳定性能的影响.本研究所制备BC酸乳具有更好的营养和保健功能，且能够减少酸乳饮料生产过程中稳定剂的使用.该研究为功能性食品的进一步开发打下了良好的基础.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

生牛乳，陕西科技大学沁园餐厅提供；嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，ST)、 保加利亚杆菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)、木糖葡糖酸醋杆菌(Acetobacterxylinum) ，陕科大实验室分离保藏 ；其余试剂均为市售分析纯或生化试剂.

种子培养基：蔗糖40～50 g/L，牛肉膏10～15 g/L，磷酸氢二钠4～5 g/L，柠檬酸0.8～1.0 g/L，乙醇8～10 g/L；pH5.5～6.5.

发酵培养基：蔗糖40～50 g/L，牛肉膏10～15 g/L，磷酸氢二钠4～5 g/L，柠檬酸0.8～1.0 g/L，乙醇8～10 g/L；pH5.5～6.5.

1.1.2 主要仪器

MJ-250恒温培养箱，上海百典仪器设备有限公司；YP402N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE52CS-1型zeta电位仪，上海亚荣生化仪器厂；S-4800型扫描电镜，日立高新科技国际贸易有限公司；TDL-40B型高速离心机，上海安亭科学仪器厂.

1.2 实验方法

1.2.1 BC制备

将木糖葡糖酸醋杆菌(Acetobacterxylinum)活化，扩大培养，得种子液，将种子液接种至发酵培养基中，30 ℃下发酵10 d，将发酵液液面上层的BC膜取出水洗，80 ℃下，1.0%～1.5% NaOH溶液中浸泡30 min，水洗至BC膜呈透明状，在110 ℃下干燥，得到BC，再将BC匀浆(15 000 r/min，4 min)可得絮状BC.

1.2.2 酸乳制备

移取15 mL新鲜生牛乳于厌氧管中， 95 ℃灭菌20 min，冷却后分别按5%接种量接种LB和ST，45 ℃培养3 h，得发酵剂.取150 mL脱脂鲜牛乳置于250 mL蓝口瓶中，加入2%蔗糖，封装杀菌，按总接种量10%接入发酵剂(LB∶ST=1∶1)，45 ℃发酵4 h得发酵乳.发酵乳经搅拌(15 000 r/min,10次,15 min)得中间乳，将絮状BC加入中间乳中，经均质(400 Pa,10次)、后熟(4 ℃，12 h)得BC酸乳成品.

1.2.3 BC酸乳制备工艺优化

选10名有经验的品尝人员对产品进行品尝，采用100分制评分法，从组织状态、沉淀析出情况、口感、风味四个方面进行感官评价(表1)[19]，以BC酸乳分层时间和感官评价分数为评价指标，分别对发酵乳含量(30%、35%、40%、45%、50%)、BC添加量(2.5%、3%、3.5%、4%、6%)、CMC/黄原胶(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 )进行单因素实验，确定各因素对BC酸乳制备的影响及其适宜水平.

根据单因素实验结果，选择对BC酸乳制备影响较大的因素进行正交试验,以感官评分及分层时间为考核指标，确定BC酸乳制备最优工艺.采用酸碱滴定法测定所制备BC酸乳酸度；采用PHS-2 酸度计测定pH；采用平板法测定活菌数.

表1 BC酸乳感官评分标准

1.2.4 BC酸乳形貌表征

将BC酸乳储存于冷藏柜中，观察其凝乳状态；对BC及BC酸乳冷冻干燥后喷金处理，利用 SEM 观察其微观形貌.

1.2.5 BC酸乳的稳定性能

(1)环境应力对BC酸乳稳定性的影响

制备BC酸乳，将其稀释至不同质量浓度(5%、10%、15%)，分别测定其在不同pH(3、4、5、6、7、8)，NaCl溶液(50 mol/L、100 mol/L、150 mol/L、200 mol/L、250 mol/L)和温度(0、30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃)下的沉淀率，研究环境应力对BC酸乳稳定性的影响.沉淀率采用以下方法进行测定：取10 mL BC酸乳，质量记为W1，3 000 r/min离心10 min，倾去上层清夜，将沉淀物在100 ℃下烘干60 min，质量记为W2可采用公式(1)计算BC酸乳沉淀率：

(1)

(2)环境应力对BC酸乳δ电位的影响

分别取50 mol/L、100 mol/L、150 mol/L、200 mol/L、250 mol/L NaCl溶液，稀释BC酸乳至1%，室温下存储24 h， 3 000 r/min离心10 min，利用zeta电位测定仪测定样品表面电荷分布情况.每份样品测定三次，取其平均值.

2 结果与讨论

2.1 BC酸乳制备工艺优化

2.1.1 BC酸乳制备工艺优化单因素实验

(1)发酵乳含量对BC酸乳的影响

由图1可知，随着发酵乳含量增大，分层时间及感官评价整体呈现上升趋势.当发酵乳含量为30%时，发酵乳会出现明显的发酵香味不足，口感稀薄等问题；当发酵乳含量达40%时，储存12天之后出现分层，且感官评价分数最高，当发酵乳含量达到更高时，分层时间和感官评级分数均下降，由此可见发酵乳含量过高会使得BC与酪蛋白过度结合从而影响互传三维网状结构进而导致酸乳稳定性降低，且发酵乳过多会导致一定程度上的乳清分离进而影响酸乳口感.

图1 发酵乳含量对BC酸乳的影响

(2)BC添加量对BC酸乳的影响

由图2可知，2.5%～4%的添加量对酸乳的色泽，凝结状态，口感都有较好的影响.随着BC添加量的增大，当BC添加量为6%时，样品分层时间与感官评价分数有所降低，这是由于BC亲水基团与酪蛋白结合，对水分的束缚能力加强，因而乳清的析出速率慢.此外，BC添加量为4%的样品无沉淀析出，酸度适中，口感清爽有酸奶香味，故选取4%作为酸乳的BC添加量.

图2 BC添加量对BC酸乳的影响

(3)复配稳定剂比例对BC酸乳的影响

由图3可知，以CMC为主体稳定剂，分别配以明胶、黄原胶和海藻酸钠，当CMC与黄原胶复配使用时，酸乳稳定性相对较好，且当其比例为1∶2时，稳定性效果最佳，CMC与海藻酸钠复配效果次之，与明胶复配效果最差.

图3 复配稳定剂比例对BC酸乳的影响

2.1.2 BC酸乳制备工艺优化正交试验

设计三因素三水平的正交试验，试验设计如表2所示，试验结果如表3所示.由表3可知，三因素对BC酸乳的影响主次顺序为：BC添加量>发酵乳含量>复配稳定剂(CMC/黄原胶总量为0.5%)比例.各因素的最优水平是A1B1C1，即BC的添加量为3%、发酵乳含量为35%、复配稳定剂CMC/黄原胶=1∶1，复配稳定剂总量为0.5%，如表4所示.在此条件下制备的BC酸乳在4 ℃下贮存33天后开始分层，感官评价分数为95分，酸度为79 °T，pH为4.62，活菌数为1.79×108cfu/mL.

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验结果

表4 BC酸乳理化性质

2.2 BC酸乳形貌

2.2.1 BC酸乳表观形貌

图4所示为不同BC添加量酸乳外观形貌.BC酸乳中，BC纤维束通过非共价相互作用附着于酪蛋白上，均匀地分散在蛋白质中，可能是由于在低温条件下形成大量氢键，这使得BC与蛋白质通过良好的网络互穿作用相互结合，因此所形成的乳液最稳定.

由图4可知，BC酸乳呈现乳白色，未见明显分层，气味清香 ，其中，加入4%的BC酸乳外观稳定性最好.未加BC时，酸乳分层时间较快且口感略差；加入2% BC时，其添加量太少，不足以形成强的三维网络结构来更好的稳定酸乳；加入6%的BC时，BC分布不均匀，连续的蛋白质网络被破坏，蛋白质和BC发生聚集，影响酸乳的稳定性而导致分层.

图4 不同BC添加量的酸乳

2.2.2 BC酸乳微观形貌

对BC微观形貌进行测定，结果如图5所示.其中，图5(a)、(b)为BC的表面形貌SEM， (c)、(d)为断层形貌SEM.由图5可知，BC具有典型的三维网状层状结构，各纤维丝相互缠绕形成致密的网络,正是由于其复杂的三维网络结构可与酪蛋白结合，从而起到稳定乳液的作用.

图6所示为BC酸乳中固形物的微观形貌.新鲜生牛乳中酪蛋白占牛乳蛋白总量的80%～82%，因此，为解决乳蛋白在酸性条件下的变性沉淀，需研究稳定剂与乳蛋白之间的相互作用.将BC作为稳定剂加入，其中一部分BC与蛋白质颗粒发生静电相互作用同时吸附在蛋白质颗粒的表面，以此来提供空间位阻效应来维持酪蛋白在酸性条件下的稳定性；另一部分BC以增加体系粘度的方式减缓酪蛋白的沉降速率.

总体而言，其致密的微观结构说明了BC氢键含量较多且可通过氢键作用与蛋白质良好兼容.此外，BC纤维丝束同样与蛋白质聚集体连接在一起，在酸乳中加入BC也影响了蛋白质的聚集，BC之间形成了三维结构，这种三维网状结构可以将蛋白质分开来阻止蛋白质的聚集也能够使蛋白原嵌入其中，这种互穿三维网络结构更不易聚集形成沉淀.

(a)表面放大5K (b)表面放大50K

(c)断层放大2K (d)断层放大10K图5 BC表面及断面形貌SEM图

(a)非BC酸乳微观放大20 K (b)BC酸乳横面微观放大20 K

(c)BC酸乳截面微观放大20 K (d)BC酸乳微观放大50 K图6 BC酸乳的微观形貌

2.3 BC酸乳稳定性能

2.3.1 环境应力对BC酸乳稳定性能的影响

(1)pH对BC酸乳稳定性能的影响

酪蛋白胶粒之间有三种作用力，即范德华相互吸引作用、静电排斥作用和空间位阻作用.κ-酪蛋白的“发层”或称之为“聚电解质刷”提供了空间位阻作用，即当胶粒相互碰撞时，在作用区域伸展于胶束表面的κ-酪蛋白分子将损失构型熵并提供排斥力，防止酪蛋白粒发生聚集.这种作用表明了酪蛋白表面的κ-酪蛋白向外延伸的高度(电解质刷高度H)与溶液pH之间的关系.

由图7可知，当BC的浓度较高时，其与酪蛋白的结合更加活跃而使其乳液更稳定.随着pH值的增大，其沉淀率逐渐减小，由于酪蛋白本身的等电点PI为4.6，到达酪蛋白等电点使会快速沉淀酪蛋白.当pH值从3增大到5时，其沉淀率减小的较快，当pH从5增大到6时，其沉淀率变化较小，说明此时的BC酸乳最稳定，过酸则会影响BC酸乳的稳定性.

图7 pH对BC酸乳稳定性能的影响

(2)离子强度对BC酸乳稳定性能的影响

BC是一种水不溶性且电负性极弱的阴离子多糖，BC酸乳的稳定性同时受到BC添加量及环境离子强度的共同影响.

由图8可知，当BC浓度较低时，酸乳中的酪蛋白与BC间的非共价相互作用远大于静电排斥作用，起主导作用的为非共价相互作用，因此BC与酪蛋白静电排斥作用较弱，不足以充分结合酪蛋白并对其进行稳定，当BC浓度较高时，BC的三维网状结构使酪蛋白颗粒大量结合于其网状结构中，使得BC酸乳沉淀率下降，稳定性提高.即在相同离子强度下，BC酸乳稳定性随着BC加量的增大而提高.

另一方面，当BC浓度较低时，随着离子强度的增大，BC酸乳沉淀率逐渐增大，稳定性呈现下降的趋势；当BC浓度较高时，沉淀率随离子强度的增大变化较小，表明BC可以减小离子强度对酸乳的影响.

图8 离子强度对BC酸乳稳定性能的影响

(3)温度对BC酸乳稳定性能的影响

BC纤维束与蛋白质网络之间通过非共价相互作用形成互穿三维网络结构.由于氢键可能在低温条件下更容易形成，而氢键的形成同样利于体系内部与酪蛋白的结合.

由图9可知，BC酸乳稳定性随环境温度的变化呈小幅度降低的趋势.因此当温度从30 ℃增加到50 ℃时，其沉淀率稍有增加，当温度从50 ℃增加到90 ℃时，其沉淀率变化不大，表明BC的网络结构受较高温度影响较小，因此温度变化对酸乳的稳定性影响不大.

图9 温度对BC酸乳稳定性能的影响

2.3.2 环境应力对BC酸乳δ电位的影响

(1)pH对BC酸乳δ电位的影响

在BC酸乳体系中，一部分BC吸附于酪蛋白颗粒上形成复合物结构使得空间稳定，另一部分会在复合物表面形成一层凝胶网络来增强一部分稳定性.

由于在稳定乳液中存在静电相互作用，在接近中性的条件下，静电相互作用主要来源于酪蛋白中电离的酸根基团.当两个具有扩散双电层的酪蛋白胶束非常接近时，两个双电层的扩散部分就会开始重叠，重叠的结果会导致排斥，这种排斥作用的自由能由能够直接测量的δ电位所取代.

由图10可知，BC酸乳的δ-电位均为负值，当pH值从3增加到7乳液液滴的δ电位绝对值随着pH值的增加而增加，表明可通过调节体系pH从而改变电荷大小，当有较大静电斥力存在于液滴之中时，BC酸乳具有更好的稳定性.

图10 pH对BC酸乳δ电位的影响

(2)离子强度对BC酸乳δ电位的影响

BC酸乳颗粒具有相当均匀的表面，液滴的表面有性质类似于粒子本身的颗粒存在，BC可以通过皮克林机制和网络机制有效的稳定酸乳体系，皮克林机制是BC可以附着在油滴表面阻止油滴聚集，网络机制指酪蛋白与BC之间形成强的网络结构，由此形成的密集网络可以将水和脂肪都束缚在里面而不能或者只能稍微移动，因而阻止了相的分离，从而提高了乳液的稳定性.

由图11可知，BC酸乳乳液液滴的δ电位绝对值随着NaCl浓度的增加而降低，当NaCl浓度从0 mol/L增加到250 mol/L时，乳液液滴δ电位绝对值从26.2mv减小到12.5mv，即静电斥力变小，体系稳定性降低.因此较高离子强度环境不利于BC酸乳的稳定.

图11 离子强度对BC酸乳δ电位的影响

3 结论

BC酸乳制备的最优工艺为：发酵乳含量为35%、BC的添加量为3%、复配稳定剂CMC/黄原胶=1∶1、复配稳定剂总量为0.5%，所制得的BC酸乳具有较好的稳定性.酸乳中的酪蛋白可与BC网络之间以非共价相互作用形成互穿三维结构，从而稳定酪蛋白，改善酸乳脂肪上浮和蛋白质沉淀等问题，同时BC的加入可减小环境应力对BC酸乳稳定性能的影响.

研究结果表明，BC可以作为稳定剂用于膳食纤维酸乳制备，减小环境应力对BC酸乳的影响，且对于酸乳品质有良好的改善作用.与现有研究对比[20-24]，单一稳定剂的使用或其他复配稳定剂的使用可以在一定程度上提高酸乳稳定性，但是成本较高且依然存在稳定能力不足、口感不佳等问题.而本研究将BC与复配稳定剂联合使用，在一定程度上降低了成本，为BC作为稳定剂产业化应用提供了思路.这充分表明BC在酸乳工业具有良好的应用前景.