桦褐孔菌多糖对牦牛酸乳品质的影响

许英瑞，吴世芳，杨晓丽，薛元泰，朱妍丽，张卫兵，赵 军，文鹏程,*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省商业科技研究所有限公司，甘肃 兰州 730010；3.青海雪峰牦牛乳业有限责任公司，青海 海南藏族自治州 813000）

牦牛作为一种长期生存于高海拔、寒冷地区的物种[1]，恶劣的环境条件使其所产的乳汁比其他物种具有更高的营养价值[2]。研究表明[3]，荷斯坦牛乳中干物质含量为16.3%、脂肪含量为5.6%、蛋白质含量为4.68%，而牦牛乳中的干物质含量为19.0%、脂肪含量为8.8%、蛋白质含量为5.41%，二者相比较，牦牛乳的营养成分含量更高，因此，牦牛乳被誉为“天然绿色浓缩乳”[4]。牦牛乳不仅营养价值高、绿色天然、无污染，还具有抗高血压、抗糖尿病和抗癌等药用价值[5]，这使得牦牛乳成为世界范围内的研究热点。

牦牛乳作为一种地域特色资源，藏区牧民自行消费占比较大，能够带来的额外收益非常有限，所以有必要大力发展牦牛乳产业，充分利用并开发这项资源。酸乳是一类以鲜乳为原料、经乳酸菌发酵而成的发酵乳制品，不仅具有比鲜乳更高的营养价值，而且还能通过乳酸菌的发酵代谢作用产生多种生物活性物质，从而为人体提供更强的益生性，同时，酸乳所具有的独特风味同样使其成为最受消费者喜爱的食品之一[6-7]。

研究[8-9]发现，与牛乳酸乳相比，牦牛酸乳的总固形物、蛋白质、脂肪、乳酸、矿物质（如钙、磷和镁）以及VB和VC含量更高；除了优越的营养特性，最新的研究还发现牦牛酸乳具有降低人体胆固醇水平、调节血糖、增强机体免疫力、抗氧化能力、抗动脉粥样硬化等多种保健功能[10]，这为丰富牦牛乳产业提供了新的思路。

桦褐孔菌作为一种药用真菌，已被广泛用于治疗各种病症[11]，如胃癌、肠癌、肝癌、糖尿病等[12]，而发挥药理功能的主要成分是桦褐孔菌中的多糖类物质[13]，具有很高的研究价值。近几年的研究表明，将活性多糖应用于发酵乳中，可以对发酵乳的品质起到显著改善作用，然而将多糖类物质应用于牦牛酸乳的生产却鲜有报道。因此，本研究首先通过液体深层发酵技术生产桦褐孔菌，并提取桦褐孔菌多糖，将多糖作为益生因子应用于牦牛酸乳的生产，采用单因素试验确定最佳多糖添加量，进一步优化桦褐孔菌多糖牦牛酸乳的生产工艺，基于最佳工艺分别生产桦褐孔菌多糖牦牛酸乳与不添加桦褐孔菌多糖牦牛酸乳，比较其品质差异，研究桦褐孔菌多糖对牦牛酸乳的品质改善效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛乳采自甘肃甘南藏族自治州；嗜热链球菌G2、副干酪乳杆菌L9保存于甘肃农业大学食品科学与工程学院功能乳品工程实验室；桦褐孔菌（CBS314.39）购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。

PDA固体培养基、液体种子培养基、玉米发酵培养基、MRS培养基、GM17培养基 海博生物技术有限责任公司。

葡萄糖、磷酸二氢钾、氯化钙、磷酸二氢钾、浓硫酸、苯酚（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C pH计 上海科学仪器股份有限公司；SW-CJ-2FD双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；YX280不锈钢压力蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机 上海湘仪离心机仪器有限公司；HG303-4电热恒温培养箱、HWS26电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；XHF-D高速分散器、Scientz-ND真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技公司；TA.XT Express质构仪英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

1.3.1.1 桦褐孔菌的活化

无菌环境下，挑取少许桦褐孔菌原始菌种菌丝体，转接于PDA固体培养基，28 ℃培养至菌丝体长满整个平板，重复操作2 次，完成菌种活化[14-15]。

1.3.1.2 嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9的活化

无菌环境下，分别称取嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9的冻干菌粉0.06 g于100 mL生理盐水（0.85 g/100 mL）中，复水0.5 h，以10 倍梯度稀释法取10－4～10－8浓度梯度涂布平板，放置于37 ℃恒温培养箱培养48 h后挑取生长良好的单菌落划线培养3 代，经镜检确定为纯种菌后保存于4 ℃冰箱备用。挑取已完成纯化的单菌落于液体培养基中活化培养3 代，完成菌种活化[16-17]。

1.3.2 桦褐孔菌菌丝体及多糖的制备

1.3.2.1 桦褐孔菌液体种子与菌丝体的制备

无菌环境下，用接种铲取1 cm2大小的固态桦褐孔菌菌丝体培养物（加入适量无菌水，用研钵研磨至均匀）于100 mL液体种子培养基，28 ℃静置3～4 d，直至出现半透明状菌丝体小球，将种子培养物置于恒温摇床（28 ℃、150 r/min）培养4 d，获得液体种子；将液体种子以体积分数10%接种于玉米发酵培养基，振荡培养（28 ℃、150 r/min）10 d，获得目标产物，将培养完成后的液体菌种用3 层纱布过滤，留菌丝体小球备用，用磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L、pH 7.4）洗去菌丝体小球表面的培养基成分后，置于40 ℃烘箱烘干后粉碎，保存于4 ℃冰箱备用[18-20]。

1.3.2.2 桦褐孔菌多糖的制备

参考禚同友等[21]的方法并稍作修改。称取一定量的桦褐孔菌菌丝体粉末，按75 mL/g的液料比加水溶解，置于80 ℃环境下水溶提取2.5 h，6 000 r/min离心15 min后取上清液，将上清液浓缩至原体积的1/4后添加4 倍体积的乙醇（体积分数95%），于4 ℃冰箱静置24 h，再离心（8 000 r/min、10 min），沉淀用无水乙醇清洗3 次，以除去脂类物质，收集沉淀物并冻干，得到桦褐孔菌菌丝体粗多糖。

1.3.3 桦褐孔菌多糖牦牛酸乳的工艺优化

1.3.3.1 发酵剂的制备

分别挑取副干酪乳杆菌L9与嗜热链球菌G2的单菌落于MRS、GM17液体培养基中活化3 代，将活化完成后的液体菌种按体积分数3%的接种量接种于脱脂乳培养基，42 ℃培养至凝乳状态，得到发酵剂。

1.3.3.2 酸乳的制备工艺

操作要点：均质[22]：20 MPa均质5 min；预热、配料：缓慢搅拌，预热至80 ℃；杀菌[23]：95 ℃条件下灭菌5 min；冷却、接种：待杀菌结束后转移至超净工作台中冷却至（40±2） ℃，按比例接入发酵剂后恒温发酵；后熟：发酵结束后转入4 ℃冰箱放置24 h完成后熟。

1.3.3.3 桦褐孔菌多糖添加量的确定

在发酵时间12 h、发酵温度42 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL、发酵剂复配比1∶1的条件下，将桦褐孔菌多糖按不同添加量（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）添加于牦牛酸乳中，以感官评分及滴定酸度为评价指标确定桦褐孔菌多糖在牦牛酸乳中的最佳添加量。

1.3.3.4 单因素试验设计

嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9发酵剂复配比：设置发酵时间为12 h、发酵温度42 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL，考察嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9复配比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）对酸乳感官评分及滴定酸度的影响。

发酵时间：设置发酵剂复配比为1∶1、发酵温度42 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL，考察发酵时间（8、10、12、14、16 h）对酸乳感官评分及滴定酸度的影响。

发酵温度：设置发酵剂复配比为1∶1、发酵时间12 h、蔗糖添加量7 g/100 mL，考察发酵温度（38、40、42、44、46 ℃）对酸乳感官评分及滴定酸度的影响。

蔗糖添加量：设置发酵剂复配比为1∶1、发酵时间12 h、发酵温度42 ℃，考察蔗糖添加量（5、6、7、8、9 g/100 mL）对酸乳感官评分及滴定酸度的影响。

1.3.3.5 正交试验设计

在单因素试验基础上，选取发酵剂复配比、发酵时间、发酵温度、蔗糖添加量4 个单因素进行牦牛酸乳制备工艺的优化，以酸乳感官评分结合滴定酸度为指标设计正交试验，因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平Table 1 Level and code of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3.6 感官评定

由10 位本实验室具有丰富感官评价经验的研究生组成感官评价小组，分别对桦褐孔菌多糖牦牛酸乳的色泽、气味、口感和组织状态进行打分，评分标准见表2。

表2 牦牛酸乳感官评定标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of yak yogurt

1.3.4 桦褐孔菌多糖酸乳品质评价

以正交试验最佳生产工艺条件为基础生产牦牛酸乳，不添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳为对照组，添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳为处理组，通过测定2 组牦牛酸乳的品质研究桦褐孔菌多糖对牦牛酸乳品质的改善效果。

1.3.4.1 酸乳活菌总数测定

采用GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[24]所述方法进行测定。

1.3.4.2 酸乳滴定酸度及pH值测定

滴定酸度测定：采用GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》[25]所述方法；pH值测定：采用pH计直接测定，将酸乳放置于室温条件下并搅拌均匀，插入电极头直接测定其pH值。

1.3.4.3 酸乳持水力测定

采用Ferragut等[26]的方法并稍作修改，取干净离心管称质量（m1，g），然后量取约5 mL酸乳置于离心管中并记录其质量（m2，g），离心（5 000 r/min，15 min），弃上清液后记录离心管的质量（m3，g）。持水力按下式计算。

1.3.4.4 酸乳质构测定

采用质构仪A/BE-35探头测定。测试条件：测定速率2.0 mm/s，测前速率5.0 mm/s，探头下降距离20 mm；每组平行测定3 次。

1.3.4.5 酸乳风味测定

萃取头老化：将萃取头与进样器连接并插入进样口，推进手柄杆，伸出纤维头，270 ℃老化处理1 h，直到无色谱峰出现、基线稳定，缩回纤维头。

样品处理：取酸乳样品20 g于50 mL萃取瓶，加入磁力搅拌转子，旋紧瓶盖，45 ℃吸附萃取30 min，萃取结束后迅速将萃取头插入气相色谱仪的进样口，解吸5 min，每组平行测定3 次。

检测条件：气相色谱条件：HP-INNWAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm），采用程序升温方式，起始温度为60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升温到255 ℃，保持20 min；进样口温度260 ℃，载气为He；恒压模式：10 psi（68.95 kPa），分流比为5∶1；质谱条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV，接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，溶剂延迟8 min，质量扫描范围25～550 u。

1.4 数据处理

数据统计采用Excel软件，绘图采用Origin 2018软件，结果采用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析进行显著性分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌多糖添加量的确定

图1 桦褐孔菌多糖对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响Fig. 1 Effect of Inonotus obliquus polysaccharides on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yogurt

由图1可知，桦褐孔菌多糖添加量对牦牛酸乳的感官评分及滴定酸度影响显著（P＜0.05）。随着桦褐孔菌多糖添加量的增大，牦牛酸乳的感官评分呈现先增大后减小的趋势，当桦褐孔菌多糖添加量为0.4%时，牦牛酸乳的感官评分最高。酸乳的滴定酸度能够较大程度地影响其口感，滴定酸度较高或较低都会引起不适，综合考虑，添加0.4%桦褐孔菌多糖进行牦牛酸乳的工艺优化试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 发酵剂复配比对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响

图2 发酵剂复配比对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响Fig. 2 Effect of starter culture composition on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt

目前市场上的酸乳发酵多采用混合菌种发酵，不同菌种在酸乳发酵阶段分别控制产酸、产香特性。由图2可知，当发酵剂中副干酪乳杆菌L9含量较高时，牦牛酸乳的滴定酸度较大，口感明显不适；当嗜热链球菌G2含量较高时，酸乳的凝乳表现较差，乳清析出严重。2 种发酵剂菌种含量过高或过低都会对酸乳的口感造成负面影响，当嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9发酵剂复配比为1∶1时牦牛酸乳感官评分最高，且酸度适口。

2.2.2 发酵时间对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响

图3 发酵时间对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响Fig. 3 Effect of fermentation time on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt

由图3可知，随着发酵时间的延长，牦牛酸乳的感官评分及滴定酸度均显著上升（P＜0.05），当发酵时间达到12 h时，牦牛酸乳的感官评分及滴定酸度与发酵14 h相比差异不显著，此时酸乳凝乳状态良好，酸度适中，故较适发酵时间为12 h。

2.2.3 发酵温度对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响

环境温度能够显著影响乳酸菌的生长繁殖，由图4可知，发酵温度处于44～46 ℃时，乳酸菌的生长条件被高温抑制，从而导致酸乳的产酸、产香不足，使牦牛酸乳感官得分较低。当发酵温度处于40～42 ℃时，牦牛酸乳口感较佳，且感官评分及滴定酸度差异均不显著，故选择较低的40 ℃作为发酵温度进行优化试验。

图4 发酵温度对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响Fig. 4 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt

2.2.4 蔗糖添加量对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响

图5 蔗糖添加量对牦牛酸乳感官评分及滴定酸度的影响Fig. 5 Effect of sucrose addition on sensory evaluation score and titratable acidity of yak yoghurt

蔗糖作为一种碳元素含量丰富的物质，可以作为营养成分用于酸乳的发酵代谢过程，为酸乳带来更加丰富的风味与更好的凝乳表现，过低的蔗糖添加量会导致酸乳凝乳性能较差、口感较酸等问题，而过高的蔗糖添加量则会掩盖酸乳原本特有的发酵香味，导致酸乳甜度较高。由图5可知，当蔗糖添加量为5～8 g/100 mL时，随着蔗糖添加量的增大，牦牛酸乳的感官评分及滴定酸度均有所提升且提升效果显著（P＜0.05），在蔗糖添加量为8 g/100 mL的条件下，感官评分及滴定酸度均为最高值，此时酸乳的口感细腻润滑、酸甜可口。

综上所述，选取嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9发酵剂复配比为1∶1、发酵时间为12 h、发酵温度为40 ℃、蔗糖添加量为8 g/100 mL为较适参数，进行牦牛酸乳制备工艺正交优化试验。

2.3 正交试验结果

由表3可知：单因素试验中影响桦褐孔菌多糖牦牛酸乳感官评分的因素依次为发酵剂复配比＞蔗糖添加量＞发酵温度＞发酵时间，最优发酵工艺为A2B3C1D2，即发酵剂复配比1∶1、发酵时间14 h、发酵温度38 ℃、蔗糖添加量8 g/100 mL；各因素对桦褐孔菌多糖牦牛酸乳滴定酸度影响的顺序依次为发酵时间＞发酵剂复配比＞发酵温度＞蔗糖添加量，最优发酵工艺为A2B3C2D1，即嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9发酵剂复配比1∶1、发酵时间14 h、发酵温度40 ℃、蔗糖添加量7 g/100 mL。由4 项单因素试验结果可知，发酵剂复配比、发酵时间、发酵温度和蔗糖添加量均可显著影响牦牛酸乳的品质（P＜0.05）；正交试验采用双重指标考察多糖牦牛酸乳的品质，得出的最佳工艺条件虽有所差异，但大体接近。考虑到若将酸乳的滴定酸度作为评测桦褐孔菌多糖牦牛酸乳的唯一指标，可能会造成酸乳口感不均衡、凝乳性能表现较差等问题，综合考虑，将感官特性作为评价指标对牦牛酸乳进行测评。得出正交试验最佳工艺条件为发酵剂复配比1∶1、发酵时间14 h、发酵温度38 ℃、蔗糖添加量8 g/100 mL，在此工艺条件下发酵得到的桦褐孔菌多糖牦牛酸乳发酵香味浓郁、凝乳表现良好、口感细腻。

表3 正交试验结果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

2.4 桦褐孔菌多糖酸乳品质指标测定结果

2.4.1 活菌总数、滴定酸度、pH值及持水力

采用最佳工艺条件发酵生产牦牛酸乳，由表4可知，与对照组相比，桦褐孔菌多糖酸乳乳酸菌活菌总数增加34.1%，滴定酸度增加11.0%，pH值也相应地有所下降，持水力增加16.8%。

表4 牦牛酸乳部分品质指标测定结果Table 4 Quality attributes of yak yogurt with and without added Inonotus obliquus polysaccharides

2.4.2 质构特性

表5 牦牛酸乳质构测定结果Table 5 Texture measurement of yak yogurt with and without added Inonotus obliquus polysaccharides

质构特性作为酸乳部分指标的数据体现，能够对品质做出客观评价，并且与产品质量稳定性密切相关[27]。由表5可知，桦褐孔菌多糖可以大幅提升牦牛酸乳的硬度与黏度，但内聚性和黏度指数相较于无多糖牦牛酸乳有所下降。造成这一现象的原因可能是低含量的多糖与乳中的酪蛋白产生分子间作用力，促进了酪蛋白的相互聚集[28]；也可能是由于桦褐孔菌多糖首先对乳酸菌产生增殖作用，使得胞外多糖的产量增大，胞外多糖再通过与酪蛋白相互结合并聚集，提高了酸乳的黏度和胶着性[29]。

2.4.3 风味

表6 牦牛酸乳挥发性风味物质测定结果Table 6 Analysis of volatile flavor substances of yak yogurt with and without added Inonotus obliquus polysaccharides

由表6可知，未添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳共检测出5 种特征风味物质，而添加了桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳共检测出12 种特征风味物质，可以看出桦褐孔菌多糖对牦牛酸乳的特征风味影响十分明显。未添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳，果香类风味物质相对含量为12.48%，奶油香类物质相对含量为62.94%；而添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳果香类风味物质相对含量为36.96%，牦牛酸乳的果香味得到十分明显的提升，但奶油香类风味物质相对含量相较于对照组有所下降。研究表明，桦褐孔菌多糖牦牛酸乳中的特征风味物质酮类与酚类占绝大多数，其中又以酮类居多，酮类化合物是酸乳中重要的风味物质，一般通过不饱和脂肪酸的氧化反应与热降解反应、氨基酸的降解反应产生[30]。通过对比实验组与对照组发现，桦褐孔菌多糖能够丰富牦牛酸乳中的酮类物质，使其拥有更多的特征香气，桦褐孔菌多糖可以作为一种改善牦牛酸乳风味的优良添加剂。

3 讨 论

研究前期首先确定桦褐孔菌多糖的最佳添加量，发现添加0.4%桦褐孔菌多糖对牦牛酸乳的感官特性提升效果最佳，表明适宜添加量的桦褐孔菌多糖会对酸乳的感官特性产生正面影响。Sheraji等[31]研究发现，添加芒果皮多糖的脱脂酸乳其风味、结构、酸度和颜色优于普通脱脂酸乳，说明芒果皮多糖同样可以用于提升脱脂酸乳的感官特性。Kip等[32]使用偏最小二乘法以及感官评价研究菊粉对低脂酸乳口感的改善作用，发现菊糖能够显著改善酸乳的稠度和黏度，并对口感起到积极影响。

将最佳工艺应用于桦褐孔菌多糖牦牛酸乳的生产，发现与未添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳相比，桦褐孔菌多糖牦牛酸乳的乳酸菌活菌数增加34.1%，滴定酸度增加11.0%，pH值相应地有所下降，持水力增加16.8%，可以认为桦褐孔菌多糖改善了牦牛酸乳的品质。已有研究证实，杏鲍菇多糖[33]与滑菇多糖[34]可以显著提高酸乳贮藏期间的乳酸菌活菌数，这是因为多糖含有丰富的碳源，可促进发酵乳中乳酸菌的生长与增殖。桦褐孔菌多糖能够提升牦牛酸乳的持水力、硬度与黏度，这与多糖分子的强亲水性密切相关，多糖类物质有络合水的能力，可以以共价键的形式与蛋白质分子相互作用，增强发酵乳的凝乳能力[35]。

采用气相色谱-质谱联用测定2 组牦牛酸乳的特征风味物质，结果表明，未添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳共检测出5 种风味物质，添加桦褐孔菌多糖的牦牛酸乳共检测出12 种风味物质。张素敏等[36]将海藻糖应用于酸乳中制备功能性酸乳，结果发现，全蔗糖酸乳与海藻糖酸乳中均检出100 种风味物质，本研究检测出的风味物质较少，这可能是由于测定方法与设定程序的不同所导致的。潘烨灿等[37]测定蛹虫草浸提液酸乳的风味成分，结果显示，共检测出19 种风味物质，且酮类风味物质较多，这与本研究所得结果基本一致。

4 结 论

通过液体深层发酵技术生产桦褐孔菌菌丝体并制备桦褐孔菌多糖，研究桦褐孔菌多糖添加对牦牛酸乳品质的影响。确定桦褐孔菌多糖的最佳添加量为0.4%，通过研究嗜热链球菌G2与副干酪乳杆菌L9发酵剂复配比、发酵时间、发酵温度及蔗糖添加量对牦牛酸乳品质的影响，采用正交试验优化牦牛酸乳的生产工艺参数，比较添加桦褐孔菌多糖牦牛酸乳与未添加桦褐孔菌多糖酸乳的差异，结果表明，添加桦褐孔菌多糖可显著提升牦牛酸乳中乳酸菌活菌数，提升菌株产酸能力，同时显著提升产品的持水力。本研究结果可为牦牛酸乳的品质改善提供新的思路，也可为桦褐孔菌多糖在特色乳制品中的利用提供理论依据。