羊乳蛋白质组成及消化特性

蔡俊娜，张富新，刘玉芳，许晶辉，章依婷，吴阿敏

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062）

羊乳营养丰富，富含蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质、维生素等多种营养成分[1]，具有乳脂肪球小[2]、蛋白质不易过敏、不易发生乳糖不耐症和易消化吸收的特性[1]。此外，羊乳中还含有表皮细胞生长因子[1]、胰岛素生长因子[3]、环腺苷酸[4]、乳铁蛋白[5]和免疫球蛋白[6]等生物活性物质，具有一定的营养保健功能。近年来，随着人们营养保健意识的提高，羊乳的营养保健功能已受到关注。目前有关羊乳的基本营养组成已有大量报道[1,7-9]，但有关羊乳蛋白质组成及消化特性的研究相对较少。因此本研究对羊乳酪蛋白和乳清蛋白进行分离，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）研究蛋白质组成及酪蛋白和乳清蛋白的消化特性，为评价羊乳蛋白质的营养及开发利用羊乳提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊乳采自西北农林科技大学试验农场150 只萨能奶山羊混合乳样，乳样采集后低温（4 ℃）运送至实验室，分装后于－40 ℃贮藏。

盐酸 洛阳昊华化学试剂有限公司；氢氧化钠、氯化钠、碳酸氢钠 天津市天力化学试剂有限公司；CaCl2·2H2O 天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇、甲醇、冰乙酸 天津市富宇精细化工有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、胰酶（1 750 U/g） 美国Sigma公司；猪胆盐 北京奥博星生物技术有限责任公司；甘氨酸 北京博奥拓达科技有限公司；考马斯亮蓝R-250、SDS、Tris、SDS-PAGE还原性蛋白凝胶制备试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4×）、蛋白质分子质量标准（14.4～116.0 kDa） 碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；BSA22025电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TGL-16B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；FDU1200真空冷冻干燥机 上海爱郎仪器有限公司；FM恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司；VORTEX-5旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Power PacTM基础电泳仪电源、Mini-Protean®Tetra Cell电泳槽 上海创萌生物科技有限公司；THZ-300/300C恒温培养摇床 上海一恒科学仪器有限公司；ChemiDoc-it System 510 Imager化学发光成像仪 美国UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳酪蛋白和乳清蛋白的制备

为了更精确研究羊乳中蛋白质的消化特性，避免SDS-PAGE中蛋白质消化产物对电泳条带的影响，将羊乳中酪蛋白和乳清蛋白进行分离。羊乳在3 500×g条件下离心20 min，置于－20 ℃冰箱15 min后去除上层脂肪。用1.0 mol/L HCl将脱脂乳pH值调整至羊乳酪蛋白等电点4.2，静置30 min后，在3 000×g条件下离心30 min，沉淀部分为酪蛋白，上清液为乳清[10-11]。用0.1 mol/L HCl将乳清的pH值调至4.0，90 ℃加热25 min，冷却至室温（25 ℃），在10 000×g条件下离心20 min，沉淀部分为乳清蛋白[12-13]。以上步骤重复3 次，得到的酪蛋白和乳清蛋白用真空冷冻干燥机制成酪蛋白粉和乳清蛋白粉，用于酪蛋白和乳清蛋白的体外模拟消化实验。

1.3.2 SDS-PAGE

参照王银等[14]的方法，用2.25 mL 30 g/100 mL丙烯酰胺（29 g丙烯酰胺、1 g双丙烯酰胺，超纯水定容至100 mL）、1.25 mL pH 8.8 Tris-HCl、50 μL 10 g/100 mL SDS、50 μL 10 g/100 mL过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）、5 μL四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和1.4 mL超纯水制备13.5%的分离胶；用0.313 mL 30 g/100 mL丙烯酰胺、0.313 mL pH 6.8 Tris-HCl、25 μL 10 g/100 mL SDS、37.5 μL 10 g/100 mL APS、3.75 μL TEMED和1.813 mL超纯水制备3.75%的浓缩胶。将13.5%的分离胶注入凝胶板中凝胶40 min后加入3.75%的浓缩胶，凝胶40 min，完成制胶。

将1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白分别用超纯水稀释10 倍，制备样品稀释液，取30 μL样品稀释液，加入10 μL蛋白上样缓冲液，沸水浴加热5 min完成样品处理。将3.03 g Tris、18.7 g甘氨酸、1 g SDS定容至1 L，配成电极缓冲液，加入电泳槽内，然后添加样品稀释液。电泳条件：初始电泳电压为75 V，当酪蛋白和乳清蛋白样品进入分离胶后将电压调至200 V，直至样品条带完全分离。将凝胶从凝胶板上取下，在水平摇床中用染色液（1 g考马斯亮蓝R-250、450 mL甲醇、100 mL冰乙酸，定容至1 L）染色2 h，然后用脱色液（100 mL甲醇和100 mL冰乙酸，定容至1 L）脱色24 h，最后用化学发光成像仪扫描，进行条带灰度分析，样品中各蛋白质的相对含量按式（1）～（2）计算。

1.3.3 体外模拟消化

帅大叔之前都决定认栽，忍气吞声，可在凶悍男发泄完毕回到自己车上时，他的情绪被引爆了，接下来的一切便失控了。

羊乳酪蛋白和乳清蛋白分别进行体外模拟胃液消化、肠液消化、胃肠液消化。

模拟胃液消化：参照Pan Yi[15]、Hodgkinson[16]等方法，略作修改。将2 g NaCl和7 mL 2 mol/L HCl用超纯水定容至1 L，配制成人工胃液。分别取10 mL 1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白，于37 ℃预热5 min后，分别添加10 mL人工胃液，用2 mol/L HCl将pH值调整至2.5，添加胃蛋白酶（180 U/mg蛋白质）后，于37 ℃恒温水浴中分别消化30、60、120 min，用1 mol/L NaOH调整消化液pH值至7.0终止反应，取消化液进行SDS-PAGE。

模拟肠液消化：参照Moreno-Montoro[17]、Kim[18]等方法，略作修改。将68.3 mL 84.7 g/L NaHCO3、10 mL 22.2 g/L CaCl2·2H2O和30 g猪胆盐用超纯水定容至500 mL，配制成人工肠液。分别取10 mL 1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白，于37 ℃预热5 min，分别添加0.1 mL人工肠液，用1 mol/L NaOH将pH值调整至7.0，添加胰酶（34.5 U/mg蛋白质）后，于37 ℃恒温水浴中分别消化2、10、30 min，沸水浴5 min终止反应，取消化液进行SDS-PAGE。

模拟胃肠液消化：参照文献[15-18]方法，略作修改。取10 mL 1 g/100 mL酪蛋白和1 g/100 mL乳清蛋白，按上述步骤模拟胃液消化30 min后，用1 mol/L NaOH调整消化液pH值至7.0，然后模拟肠液分别消化2、10、30 min，沸水浴5 min终止反应，取消化液进行SDS-PAGE。

用化学发光成像仪对SDS-PAGE条带的灰度值进行测定，蛋白质消化率按式（3）计算[19]。

1.4 数据处理

采用Excel软件对实验数据进行整理；采用DPS 9.50统计分析软件对实验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 羊乳蛋白质组成

图1 羊乳蛋白质SDS-PAGE图Fig. 1 SDS-PAGE analysis of proteins in goats’ milk

由图1可知，羊乳蛋白质电泳条带分离清晰，可明显区分酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成；乳清蛋白主要由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白组成，此外乳清蛋白中还含有少量的乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白。

表1 羊乳蛋白质组成Table 1 Protein composition of goats’ milk

2.2 羊乳酪蛋白消化特性

图2 羊乳酪蛋白模拟胃液消化、肠液消化和胃肠液消化SDS-PAGE图（n=3）Fig. 2 SDS-PAGE analysis of simulated gastric juice digestion, intestinal juice digestion and gastrointestinal juice digestion of casein in goats’ milk (n = 3)

由图2可知，羊乳酪蛋白消化前的条带清晰，可明显区别αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，但经过胃肠液消化后的酪蛋白条带逐渐减少或消失，表明羊乳酪蛋白在胃肠液中逐渐被消化。

由表2可知，羊乳酪蛋白在胃液消化期间，随着消化时间延长，其消化率进一步提高，但4 种酪蛋白在胃液中的消化情况有一定差别，在胃液消化30 min时，αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白消化率分别为84.42%、79.17%和76.27%，αs2-酪蛋白的消化率仅为62.69%，显著低于αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白（P＜0.05），这表明在胃液消化前期αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白更易消化，随着胃液消化时间延长，4 种酪蛋白消化率差异不大，在胃液消化120 min时，4 种酪蛋白消化率达到99.00%以上，羊乳酪蛋白几乎完全消化。

羊乳酪蛋白在肠液消化2 min时，消化率高达99.00%以上，消化10 min后，酪蛋白几乎完全消化，表明羊乳酪蛋白在肠液中消化率较高，显著高于胃液消化。羊乳酪蛋白胃液消化30 min后肠液消化2 min时几乎完全消化，进一步表明羊乳酪蛋白主要在肠液中消化，这与杨博睿[11]和Jasińska[22]等的报道一致。

2.3 羊乳乳清蛋白消化特性

图3 羊乳乳清蛋白模拟胃液消化、肠液消化和胃肠液消化SDS-PAGE图（n=3）Fig. 3 SDS-PAGE analysis of simulated gastric juice digestion,intestinal juice digestion and gastrointestinal juice digestion of whey protein in goats’ milk (n = 3)

由图3可知，羊乳乳清蛋白电泳条带清晰，可明显观察到α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白条带，但经过胃肠液消化后的蛋白条带逐渐减少或消失，表明羊乳乳清蛋白在胃肠液中逐渐被消化。

由表3可知，乳清蛋白组分在胃肠液中的消化有较大差别，乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白在胃液和肠液中的消化率显著高于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白（P＜0.05）。在胃液中消化30 min时，乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率分别为70.91%、59.49%和56.13%，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率仅为32.51%和33.14%；胃液消化60 min时，乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率分别为95.08%、89.19%和91.25%，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率仅为56.65%和42.58%；胃液消化120 min时，乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率均达到90.00%以上，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率仅为67.53%和50.82%，这表明乳清蛋白中的乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白在胃液中易消化，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在胃液中不易消化。

表3 羊乳乳清蛋白在模拟胃肠液中的消化率Table 3 Digestibility of whey protein in goats’ milk in simulated gastrointestinal juice %

乳清蛋白在肠液中消化2 min时，乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率分别为99.27%、81.97%和75.57%，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率分别为18.55%和45.53%；乳清蛋白在肠液中消化10 min时，乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的消化率均达到90.00%以上，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率仅为26.83%和54.05%。胃肠液消化（胃液消化30 min后肠液消化30 min）后α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率才达到78.48%和91.36%，这表明α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在胃肠液中难以消化。Almaas[23]、Inglingstad[24]等也报道，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在胃肠中难以消化，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是乳清蛋白中主要成分，其消化特性与其结构有关，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白中分别存在4 个和2 个分子二硫键[25]，分子二硫键的存在增加了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的稳定性，不易被消化道中的蛋白酶水解。

3 结 论

通过SDS-PAGE和模拟体外消化对羊乳蛋白质组成和消化特性进行研究，结果表明，羊乳主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，酪蛋白由αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白组成，乳清蛋白主要由α-乳白蛋白和β-乳球蛋白组成，同时还含有少量的乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白。通过对羊乳中酪蛋白和乳清蛋白的消化特性研究发现，羊乳酪蛋白比乳清蛋白更易消化，且消化主要在肠液中进行。