不同粒径牛乳脂肪球的鞘脂浓度比较

卢文燕，杨静娜，胡明月，黄啟雪，未安琪，王月影，钟凯，朱河水，韩立强

（河南农业大学 动物医学院，郑州450046）

0 引言

乳脂肪作为乳汁的主要成分，主要以乳脂肪球（milk fat globule，MFG）的形式存在。MFG的大小从0.2μm到15μm不等[1]，其大小受到生理状态、环境等条件影响[2-3]。MFG以甘油三酯核心，外面包裹着脂质和蛋白质组成的膜，称为乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）。MFGM极性脂质主要由甘油磷脂和鞘脂组成，其中鞘脂主要以鞘磷脂形式存在[4]。牛乳中MFG鞘脂含量可能受到动物品种、生理、膳食和环境因素等的影响[5]。饲喂添加亚麻籽日粮的奶牛乳汁SM含量显著升高[6]。鞘脂也在脂滴发生中起作用[7]。鞘脂作为MFGM的重要组成部分，是否影响乳脂肪球粒径目前尚不清楚，因此，本实验通过重力分层分离出不同粒径的脂肪球，质谱分析大、小粒径脂肪球的鞘脂浓度，为分析脂肪球的粒径特性提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

甲醇、乙腈、异丙醇（色谱纯），Merck；甲酸铵、氯仿（色谱纯），Fisher；尼罗红（Nile red）、甲酸（色谱纯），中国Sigma-Aldrich公司；甲基叔丁基醚（色谱纯），CNW；脂质组学标准品（纯度＞99%），Avanti公司。

1.1.2 仪器

马尔文3000激光粒度仪，英国；移液枪、离心机，Eppendorf德国；LC-MS/MS（SCIEX，QTRAP 6500+），美国；X 35倒置荧光显微镜，Olympus，日本。

1.2 实验设计

1.2.1 实验动物和饲养管理

本实验的动物饲养在河南农业大学奶牛场进行。实验所用荷斯坦奶牛在同一双列式牛舍内饲养，随机选取体型、身体状况、产犊频率和产犊日期相近的泌乳中期的8头荷斯坦奶牛的乳样进行采样分析。实验期间采用全混日粮（Total Mixed Ration，TMR），按照自由采食，自由饮水的方式进行饲养，所有实验奶牛统一管理。泌乳母牛每天早上6:00，下午15:00和晚上20:00挤奶3次，在6:00和15:00挤奶后饲喂基础日粮。基础日粮由玉米青贮和苜蓿甘草组成。

1.2.2 乳脂肪球的重力分层

参考Mesilati-StahyR等人的方法[8]，将采取的乳样样品分别混合，转移到60 mL注射器中。每组设置3个重复。注射器针头取下，并用封口膜密封，防止液体流出，室温下静置24 h，乳样可因重力因素分为六层和最上层的奶油层。24 h后，轻轻取下封口膜，使乳样液体从针孔流出，约每10 mL乳样收集于一个离心管中，从下至上分别命名为F1至F6，最上层奶油层为F7。用马尔文3000激光粒度仪分别测量每层组分的乳脂肪球粒径大小，获得粒径D[3,2]、D[4,3]、Dv（10）、Dv（50）、Dv（90）、SSA的值。取F1和F7层的牛奶样品进行尼罗河红染色和鞘磷脂含量分析。

1.2.3 F1和F7层乳脂肪球尼龙红染色鉴定

参考张宇[9]、黄啟雪[10]等人的方法，将F1和F7层脂肪球样品进行尼罗红染色。首先将F1和F7层脂肪球样品分别进行混匀稀释，加入1 mL尼罗红染料（质量浓度100μg/mL），混匀后避光染色20 min，取适量染色后的样品与琼脂糖（质量浓度5 g/L）等量混合，随后将混合物滴到至载玻片上，避光放置待样品凝固后，采用倒置荧光显微镜在500~650 nm波长出激发尼罗红荧光探针，观察脂肪球的形状和大小。

1.2.4 鞘磷脂含量分析

1.2.4.1 磷脂样品的提取

从-80℃冰箱中取出样本放在装有冰的离心管盒里解冻；样本解冻后，涡旋混匀10 s左右，离心5 min，4℃，转速3 000 r/min；取样本50μL加入到对应的离心管中，加入1 mL脂质提取液（甲基叔丁基醚∶甲醇=3∶1，体积比，含内标混合液）；涡旋2 min，超声5 min，加入200μL水；涡旋1 min，转速12 000 r/min、4℃条件下离心10 min；离心完后吸取上清液500μL到离心管中，浓缩；用200μL流动相B复溶，用于LCMS/MS分析。

1.2.4.2 色谱质谱条件

样品分析采用岛津LC-30A超高液相色谱系统与AB Sciex三重TOF高分辨率串联质谱仪耦合进行。色谱柱：Thermo AccucoreTMC30柱(2.6μm,2.1 mm×100 mm i.d.)；流动相：A相，乙腈/水（60∶40，体积比）（质量分数为0.1%甲酸，浓度10 mmol/L甲酸铵）；B相，乙腈/异丙醇（10/90，体积比）（含质量分数0.1%甲酸，浓度10 mmol/L甲酸铵）；梯度洗脱程序：0 min为A/B为80∶20（体积比），2 min为70∶30（体积比），4 min为40∶60（体积比），9 min为15∶85（体积比），14 min为10∶90（体积比），15.5 min为5∶95（体积比），17.3 min为5∶95（体积比），17.5 min为80∶20（体积比），20 min为80∶20（体积比）；流速0.35 m L/min；柱温45℃；进样量2μL。

1.2.4.3 质谱条件

电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）温度500℃，正离子模式下质谱电压5 500 V，负离子模式下质谱电压-4 500 V，离子源gas 1（GS1）310.27 k Pa，gas 2（GS2）379.225 k Pa，帘气（Curtain Gas,CUR）241.325 k Pa。在三重四极杆中，每个离子对是根据优化的去簇电压（Declustering Potential，DP）和碰撞能（Collision Energy，CE）进行扫描检测。

1.3 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 26进行数据分析，采用单因素方差分析（One way ANOVE）比较乳脂肪球粒径，T-Test分析F1和F7层鞘磷脂的含量差异，以P＞0.05表示差异不显著，*P＜0.05表示差异显著。

2 结果分析

2.1 重力分层对乳脂肪球粒径的影响

图1中，(A)D[3,2];(B)D[4,3];(C)Dv(10);(D)Dv(50);(E)Dv(90);(F)SSA。a-f：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。D[3,2]：表面积相关等效直径；D[4,3]：体积相关的等效直径；Dv(10):10%的粒子的体积径;Dv(50):50%的粒子的体积径；Dv(90):90%的粒子的体积径；SSA:比表面积。

由图1可以看出，经过重力分层后，F1-F7层之间的粒径存在明显差异。D[3,2]在F1层是2.25μm，F4层是2.71μm，F7层是3.97μm（P＜0.05）；D[4,3]在F1层是2.37μm，F4层是3.09μm，F7层是4.16μm（P＜0.05）；其他的粒径参数Dv(10)、Dv(50)和Dv(90)也从F1到F7层逐渐增加。而比表面积（SSA）则呈现出逐渐减小的变化，在F1层是2666.67 m2/kg、F4层是2214 m2/kg，F7层是1510.33 m2/kg（P＜0.05）。从这些结果可以看出F1层粒径最小，F7层粒径最大，并且与F7层相比，小粒径的F1具有更大的表面积（P＜0.05）。

图1 不同重力分层牛乳的脂肪球粒径参数

2.2 乳脂肪球尼龙红染色鉴定

为了进一步确定重力分层对乳脂肪球粒径大小的影响，用染色的方法对F1层和F7层的乳脂肪球进行鉴定。由图2可以看出乳中脂肪球因具有脂质结构能被尼罗红标记，在倒置显微镜下呈现大小不一的橘黄色球状。观察发现，F7层中出现比例较多的大脂肪球，F1层中出现较多的小脂肪球，进一步证明采用重力分层的得到的F1层是小粒径脂肪球，F7层是大粒径脂肪球。

图2 F1和F7层的乳脂球染色

2.3 乳脂肪球的鞘脂含量分析

实验选取粒径有显著差异的F1层和F7层乳脂肪球进行鞘脂的质谱分析，共鉴定到28种鞘磷脂、5种神经酰胺、2种鞘氨醇和12种糖鞘脂(图3和图4)，其中在乳中含量最高的SM（d41:1）45.90 nmol/L，含量最低的SM（d32:2）0.066 nmol/L。与F1层相比，F7层的23种SM化合物SM（d30:0）、SM（d32:0）、SM（d34:0）、SM（d36:0）、SM（d38:0）、SM（d40:0）、SM（d30:1）、SM（d32:1）、SM（d33:1）、SM（d34:1）、SM（d35:1）、SM（d36:1）、SM(d37:1)、SM（d40:1）、SM（d41:1）、SM（d42:1）、SM（d43:1）、SM（d44:1）、SM（d32:2）、SM（d34:2）、SM（d36:2）、SM（d40:2）、SM（d42:2）均有显著升高（P＜0.05），如F1层SM（d34:1）、SM（d41:1）、SM（d42:1）含量分别为4.56 nmol/L、6.22 nmol/L、3.62 nmol/L；而F7层SM（d34:1）、SM（d41:1）、SM（d42:1）含量分别为26.37 nmol/L、45.90 nmol/L、24.77 nmol/L。4种Cer化合物Cer（d16:1/24:0）、Cer（d18:1/26:1）、Cer（d18:1/24:1）、Cer（d18:1/24:0）在F7与F1层之间相比显著增加，糖鞘脂HexCer（d18:1/24:0）和鞘氨醇也SPH（d16:1）也显著增加（P＜0.05）。图3中，SM为鞘磷脂。图4中，HexCer为糖鞘脂；Cer为神经酰胺；SPH为鞘氨醇。

图3 F1层、F7层中SM化合物含量的分析

图4 F1层、F7层中神经酰胺、糖鞘脂和鞘氨醇含量的分析

3 讨论

本研究对8头泌乳期的荷斯坦奶牛乳样采集，将新鲜牛奶通过重力分层为F1-F7层，检测不同大小脂肪球中鞘脂含量，发现与F1层小粒径脂肪球相比，F7层大粒径脂肪球的鞘脂化合物含量有显著升高（P＜0.05）。

在本研究中通过重力分层发现，F7层脂肪球粒径最大，F1层脂肪球粒径最小。一般来说，脂肪球上升速度与颗粒直径的平方成正比。大脂肪球由于直径大，在牛乳中的上升速度比小脂肪球快速。本实验把牛奶放置24 h后收集各部分（F1至F7），大脂肪球已移至顶部，所以F7层脂肪球粒径最大，F1层脂肪球粒径最小。重力分离会使乳脂肪在分离柱中重新分布，放置的时间越长，大粒径的脂肪球会集中在上层[11]。在本研究中，粒径检测的结果和染色图也与此相符，从F1至F7层的粒径逐渐增大。对于比表面积（SSA）来说，越小粒径的脂肪球，其比表面积越大[12]。在本研究中结果与此类似，随着F1-F7层粒径的增大，SSA的数值逐渐减小。

牛奶中的鞘脂主要来源于乳脂球膜，是乳脂球膜的重要组成部分，对于维持乳脂球膜的结构至关重要[13]。鞘脂是一种以鞘氨醇为基本骨架的复杂脂类，主要分为鞘氨醇类、神经酰胺类、鞘磷脂类、鞘糖脂等，它们根据在烷基链长度和分支、双键的数量和位置、1-位羟基取代集团等不同可分为SM（d14:1）、SM（d34:0）、SPH（d16:1）、Cer（d16:1/24:0）等[14]。其中神经酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂不仅促进婴儿神经发育，还被证明在调节中性脂质合成或降解具有重要作用[15-16]。孙明谦等在小鼠肝脏发现21种鞘脂，其中神经酰胺可以影响糖脂代谢[17]。给奶牛饲喂葵花籽发现能够通过调控乳腺鞘脂合成酶的表达影响乳脂中鞘脂的含量[18]。徐慧发现神经酰胺类鞘脂均能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞分化，并且对脂肪细胞分化的转录调控因子PPARγ表达具有显著的抑制作用[19]。本研究通过质谱分析发现不同粒径大小脂肪球的鞘脂相关含量具有明显差异，脂肪球粒径越大，鞘磷脂和神经酰胺的含量越大，因此可以推测乳脂肪球膜的鞘脂受到脂肪球粒径的影响。

4 结 论

本研究采集泌乳期的荷斯坦奶牛乳样，通过重力分层的方法分为大粒径脂肪球和小粒径脂肪球，分析发现在大粒径的脂肪球中鞘磷脂和神经酰胺等鞘脂含量比小粒径脂肪球显著升高，说明脂肪球粒径大小影响了乳脂肪球的鞘脂含量，这一结果为更好地理解MFG的形成机理，生产具有高鞘脂含量乳制品打下基础。