PTK787对K562细胞增殖及细胞周期作用的影响*

姜杉 陈日玲 邸晓华 刘晓利 田川

酪氨酸激酶（PTKs）是一种新型血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，通过抑制酪氨酸激酶的磷酸化，阻断信号传导、酪氨酸激酶的过度激活导致其下游信号途径的激活，最终导致细胞的转化、增殖和抵抗细胞凋亡、促进细胞生存，进而与肿瘤发生、发展、预后与转归密切相关。其抑制剂中的一种PTK787可抑制多种实体肿瘤细胞的生长，已有研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[1]。本实验利用PTK787作用于K562细胞，研究其对K562细胞增殖、细胞周期的作用，以进一步探讨PTK787抗白血病细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人慢性粒细胞白血病急变期K562细胞株，购于中国科学院上海细胞库。酪氨酸激酶抑制剂PTK787由瑞士诺华公司惠赠。MTT购于美国Sigma公司。RT-PCR试剂盒、RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 K562细胞在含10%小牛血清，100μmol/L的青、链霉素的RPM1640培养液中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于各项实验。

1.2.2 PTK787对K562细胞增殖作用的细胞形态学观察 使用分别加入10 μl不同浓度的PTK787作用K562细胞48 h后，在倒置显微镜下观察细胞生长变化情况，并拍照。

1.2.3 MTT法检测PTK787对K562细胞的增殖作用 取对数生长期、生长良好的白血病K562细胞用于实验，调整各组细胞浓度为1×104个/ml，每组设3个复孔。各实验组加入含10 μl不同浓度PTK787的细胞培养液。接种完毕后在37 ℃，5%CO2条件下孵育培养12、36、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）10 μl，混匀后37 ℃，5% CO2条件下孵育4 h，加入三联细胞裂解液（SDS 10 g，异丁醇5 ml，10M HCl 0.1 ml用双蒸水溶解配成100 ml溶液）100 μ l，37 ℃温育12～20 h，用丹尼酶标仪检测各组细胞的吸光度，测定波长为570 nm。细胞抑制率=1-（实验组光密度-空白对照组光密度）/（阴性对照组光密度-空白对照组光密度）×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测PTK787对K562细胞周期作用 6孔板每孔加入等量细胞以及10 μl不同浓度的PTK787，培养48 h，冷PBS洗涤离心2次，弃PBS。用70%冰乙醇固定12 h，调整细胞浓度1×106个/ml；用冷PBS洗涤2次，弃PBS。加入PI染液0.6 ml，避光染色半小时后上流式细胞仪检测。打印DNA含量直方图，自动拟合细胞周期各时相比例。重复5次。

1.3 统计学处理 使用SPASS 13.0统计软件进行统计描述，本实验数据资料以（±s）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，多个样本均数间每两个均数的比较根据方差齐性检验，当总体方差齐同时选择LSD法；当总体方差不齐时，选择Tamhane T2法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTK787对K562细胞增殖作用情况的细胞形态学观察 以下为不用浓度PTK787作用K562细胞48 h后相差显微镜下细胞生长变化图。阴性对照组为生长48 h的K562细胞：细胞生长旺盛，形态规则，密集平铺在培养板。加入不同浓度的PTK787作用细胞48 h，且药物浓度逐渐升高，发现细胞生长明显受抑制，细胞数量、形态均有改变，呈浓度相关性。见图1。

图1 不用浓度PTK787作用K562细胞48 h后相差显微镜下细胞生长变化图

2.2 PTK787对K562细胞增殖的作用 不同浓度的PTK787作用于K562细胞12、36、48、72 h后，用MTT法检测结果见表1。表明PTK787对K562细胞有明显的抑制作用。随着PTK787浓度增加与作用时间延长，K562的增殖抑制率逐渐升高。同一时间不同浓度组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。同一浓度不同时间组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。提示PTK787作用48 h，浓度为320 μmol/L对细胞抑制最明显。继续增加浓度或延长作用时间抑制率增加不明显。（图1）。

2.3 PTK787对K562细胞周期的作用 流式细胞仪检测细胞周期表明，PTK787显著改变G1期与S期细胞比例。加入20、40、80、160、320 μmol/L PTK787的细胞组分别与阴性对照组相比较，G1期细胞比率均高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。G1期细胞组与S期细胞组各组间比较差异有统计学意义（P<0.05），但是PTK787浓度由160 μmol/L继续升高时，G1期与S其细胞比率改变不明显。提示PTK787抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与减慢G1/S期的转换有关。见表2。

表1 PTK787对K562细胞的增殖抑制率 %

表2 流式细胞仪检测不同处理组K562细胞各周期的细胞比率

3 讨论

蛋白酪氨酸激酶按其结构可分为受体酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinases，RTKs）和非受体酪氨酸激酶（non-receptor protein tyrosine kinases，nrPTKs）[2]。PTK787/ZK222584是一种新型血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。国外研究发现，PTK787可抑制多种实体肿瘤细胞的生长[3-5]，研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[6]。酪氨酸激酶在肿瘤形成过程中起着重要作用，这一方面究已经取得很多进展。酪氨酸激酶功能的失调，会导下游信号途径激活，引起细胞增殖调节紊乱，最终导致肿瘤形成[7]。本实验通过研究不同浓度PTK787作用于K562细胞后，观察对细胞增殖，细胞周期作用的影响。结果表明，PTK787具有明显抗白血病作用，主要表现在：（1）抑制K562细胞增殖，药物浓度从20 μmol/L升高到320 μmol/L，细胞的增殖抑制率明显升高（P<0.05），其中药物浓度以320 μmol/L，作用时间为48 h时细胞的抑制率最高。继续提高药物浓度和延长药物作用时间细胞抑制无明显改变；（2）阻止K562细胞周期G1期想S期转换；S期是细胞周期的关键时刻，DNA复制、蛋白合成均在S期，所以S期细胞数目降低表明细胞增殖受到抑制。

PTK787对K562细胞的生长抑制机理可能为：（1）PTK787可抑制所有已知的VEGFR酪氨酸激酶。通过与VEGFR上的三磷酸腺苷结合位点竞争性结合，抑制VEGF介导的信号传导通路，阻断新生血管的形成而抑制肿瘤的生长[8]。药物尼罗替STI571为作用于该类受体的酪氨酸激酶抑制剂。体外研究表明，STI571可降低CML细胞系的K562细胞系和KU812F细胞系以及表达野生型BCR-ABL的前B细胞系Ba/F3的BCR-ABL自主磷酸化，抑制细胞增殖[9]。（2）通过下调Bcl-2和Bcl-xL的表达诱导肿瘤细胞凋亡增加。（3）作用于肿瘤细胞生长周期的G1期、部分G2/M期，从而抑制肿瘤细胞生长[10]。（4）PTK787可下调白血病细胞FAK基因的表达，而FAK类似于癌基因的作用。从而达到抗肿瘤的作用。（5）PTK787可能通过纠正ph（﹢）CML细胞异常蛋白表达，使细胞恢复正常生长状态。以往的抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对机体正常的组织细胞也有杀伤作用。随着分子生物学技术的发展和从细胞受体与增殖调控的分子水平对肿瘤发病机制认识的进一步深入，针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗开始进入临床，人们称其为“分子靶向治疗”。临床的酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用机制可能是通过抑制肿瘤细胞的损伤修复、使细胞分裂阻滞在G1期、诱导和维持细胞凋亡、抗新生血管形成等途径实现。分子靶向对抗肿瘤细胞不仅对肿瘤细胞有很强的杀伤力，并且可使正常细胞免受损害，可大大减少化疗的副作用。

最新研究进展表明，作为促使细胞通过G1/S期限制点的细胞周期蛋白Cyclin D1的表达失常与多种肿瘤的癌变相关。在转基因动物中证明，Cyclin D1的变异参与了间变等癌变早期病理变化过程。酪氨酸激酶促进肿瘤细胞增殖的机制可能为增加细胞DNA合成和加快G1/S期的转换。酪氨酸激酶是通过增加Cyclin D1的表达与抑制p21的协同作用来促进DNA合成的，应用酪氨酸激酶抑制剂可以阻断这些过程[11]。这些结果均提示诱导酪氨酸激酶的表达对于细胞周期的调节是正性的，而Cyclin D1可能是酪氨酸激酶调节细胞周期的基本功能靶点，这为下一步的研究提供了理论基础。

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