磷丙泊酚钠注射液细菌内毒素检查的方法学研究

魏 萍，李锋武，卫星华，高 琳

(陕西省西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054)

磷丙泊酚钠商品名为 Lusedra，由美国 Eisai公司研发，于2008年12月12日由美国与食品药物管理局(FDA)批准上市，临床用作成年患者诊断或治疗操作过程的镇静催眠剂。磷丙泊酚钠是丙泊酚的一种水溶性的前体药物，该前药静脉注射给药后在体内被内皮细胞表面的碱性磷酸酶代谢，产生活性药物丙泊酚，其可在大脑组织内迅速达到平衡，从而发挥剂量依赖性镇静催眠作用[1]。为了进一步控制该药品的质量，根据2010年版《中国药典(二部)》附录ⅪE的规定[2]，建立了磷丙泊酚钠注射液细菌内毒素检查方法。

1 仪器与试药

漩涡混合器(天津天大天发设备有限公司);细菌内毒素凝胶检测仪(天津天大天发设备有限公司)。鲎试剂(TAL，厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号为111010，标示灵敏度0.25 EU/mL;批号为110605，标示灵敏度0.06 EU/mL。湛江博康海洋生物有限公司，批号为 1203080，标示灵敏度 0.25 EU/mL，批号为1102173，标示灵敏度0.06 EU/mL)。细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号为150601－201174，规格为160 EU/支);磷丙泊酚钠注射液(陕西合成药业有限公司，批号分别为 110601，110602，110603，规格 35 mg/mL);细菌内毒素检查用水(BET用水，中国食品药品检定研究院，批号为201001);Tris·HCl缓冲液(pH 7.0，厦门市鲎试剂实验厂有限公司，批号为100910)。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值确定

按细菌内毒素检查限值公式 L=K/M，其中 K为按规定的给药途径下人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5.0 EU/(kg·h)，M为人用每1 h每1 kg体重的最大剂量。根据生产厂家提供的标准给药方案，磷丙泊酚钠注射液的给药方案由首次给药和追加给药两部分组成，根据患者的体重先给予首次剂量，然后根据给药后的症状逐次追加给药，追加给药的频率不超过每4 min 1次。据此，估算1 h后可能给予的最大剂量。则 L=5.0 EU/(kg·h)÷(15+4×15)mL/80(kg·h)=5.33 EU/mL，考虑联合用药内毒素相加的安全性，可给予3倍的安全系数，即 L=1.78 EU/mL。

2.2 供试品pH测定

根据2010年版《中国药典(二部)》附录ⅪE规定，供试品溶液的pH在6.0～8.0范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的pH，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节。测定3批样品的 pH，分别为9.09，9.15，9.14。用 Tris·HCl缓冲液(pH=7.0)稀释批号 110601 供试品至 2.5，5，10，20 倍，测定其 pH 分别为 7.75，7.56，7.42，7.32。4 个稀释倍数的 pH 均在 6.0～8.0 的范围内，符合药典要求。

2.3 鲎试剂灵敏度复核

用 BET 用水将细菌内毒素工作标准品稀释成 2.0 λ，1.0 λ，0.50 λ和0.25 λ4个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行制备4支，同时用BET用水做2支阴性对照管，按细菌内毒素检查法结果判定。见表1。

表1 灵敏度复核结果

2.4 最大有效稀释倍数确定

根据最大有效稀释倍数 MVD=CL/λ，对于灵敏度为0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU/mL 的鲎试剂，供试品最大有效稀释倍数分别为 3.5，7，14，29，58 倍。

2.5 供试品干扰试验预试验

取供试品(批号为110601)，分别加Tris·HCl缓冲液(pH=7.0)制成稀释 2.5，5，10，20 倍的溶液，再分别加内毒素标准品制成含细菌内毒素0.5 EU/mL的溶液，用批号为111010及批号为1203080鲎试剂(λ=0.25 EU/mL)以初步确定供试品的最小不干扰稀释倍数，结果见表2。可见，磷丙泊酚钠注射液在稀释10倍及10倍以上稀释倍数时，对鲎试剂的凝集反应无增强或抑制作用。

表2 干扰预试验结果

2.6 供试品干扰试验

用BET用水和10倍稀释供试品(用Tris·HCl缓冲液稀释制成)分别将内毒素标准品制成 2.0 λ，λ，0.5 λ，0.25 λ 的一系列浓度，分别用2个厂家的鲎试剂同时考察3批供试品每个浓度下的干扰情况，每一浓度做4管，同时作阴性对照和阳性对照(细菌内毒素 2.0λ)，结果见表 3。Es在 0.5λ～2λ之内，Et均在 0.5 Es～2 Es之内;磷丙泊酚钠注射液10倍稀释液对标示灵敏度为0.25 EU/mL的两批不同厂家鲎试剂的凝集反应无干扰作用。

表3 干扰试验结果

2.7 样品检测

取供试品，分别用标示灵敏度为0.06 EU/mL的2个厂家的鲎试剂考察其内毒素限值，供试品溶液10倍稀释。结果见表4。

3 讨论

本试验用两个厂家的鲎试剂对磷丙泊酚钠注射液连续3个批号进行了干扰试验，结果表明，磷丙泊酚钠注射液在上述试验中无干扰作用。其内毒素限值为每1 mL磷丙泊酚钠注射液含内毒素量小于1.78 EU。

表4 磷丙泊酚钠注射液细菌内毒素检查结果

对陕西合成药业有限公司提供的3批磷丙泊酚钠注射液，用两个厂家的鲎试剂进行了细菌内毒素检查，阴性对照管呈阴性，供试品阳性管和阳性对照管均呈阳性，试验成立，3批供试品的细菌内毒素检查结果符合规定。

综上所述，认为磷丙泊酚钠注射液用细菌内毒素检查法按每1 mL含细菌内毒素量应小于1.78 EU的限值进行细菌内毒素检测是可行的。

[1]Revll P，Serradell J，Bolos J.Anesthetic drug[J].Drugs Future，2006，31(10):859－863.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录99－附录102.