参附注射液对原代培养乳鼠心肌细胞缺氧－复氧损伤的影响

王建刚，田首元

参附注射液（Shen－fu injection，SFI）是临床上常用的中药，其主要药理成分为人参皂苷和乌头碱，对心肌缺血／再灌注损伤具有保护作用[1，2]，但其作用机制还有待探讨。本研究采用原代培养的心肌细胞建立缺氧／复氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）损伤模型模拟体内缺血／再灌注损伤，研究SFI对体外培养的心肌细胞H／R损伤的保护作用，并对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 参附注射液（批号：041105，雅安三九药业有限公司），胎牛血清、低糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基（Hyclone公司，美国），胰蛋白酶（Amresco公司，美国），倒置相差显微镜（Olympus Optical公司，日本），CO2恒温细胞培养箱（Forma Scientific公司，美国）。5－溴－2－脱氧尿核苷（5－bromo－2－deoxyuridine，BrDU）。DXC800型全自动生化分析仪、Access2型免疫化学发光分析仪（Beckman公司，美国），超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。EPICS Elite型流式细胞仪（Beckman coulter公司，美国）。

1.2 原代心肌细胞培养 取出生1d～3dWistar乳鼠，雌雄不限（山西医科大学动物中心提供），75%酒精浸泡后，无菌条件下取其心脏置于预先盛有D－Hanks液的无菌平皿内，用含抗生素的D－Hanks灌冲洗两遍。取心室肌剪碎至1mm3～2 mm3大小的组织块，移入5 0mL离心管中，用适量预温的0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA 37℃水浴震荡分次消化，每次约8min，直至组织块完全消化。收集除第1次以外的单细胞悬液，放入含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，终止消化7目筛网过滤去除未消化的组织，在4℃时以1 000r／min离心10min，弃上清，收集沉淀，加入培养液（80%DMEM、20%胎牛血清、青霉素100U／mL、链霉素100U／mL和0.1mmol／L Br－DU）混悬。台盼蓝染色计数，调整细胞数至5×106／L。接种到25mL培养瓶中，置37℃培养箱（含95%空气＋5%CO2）中培养2h以纯化心肌细胞（差速贴壁法）。接种到24孔培养板中，每24h观察细胞贴壁及生长情况，并更换培养液。其中BrDU在细胞培养36h内加入以抑制非心肌细胞增殖。接种3d～4d后，用无血清的DMEM培养24h，使细胞周期同步化后行缺氧／复氧干预。

1.3 心肌细胞缺氧／复氧损伤模型建立 参照文献[3]的方法以及具体实验条件加以改进。上述原代培养的心肌细胞弃上清，换以经95%N2＋5%CO2混合气体饱和的低糖、无血清DMEM培养液，置于37℃密闭容器内（含95%N2＋5%CO2混合气体）缺氧1h后，取出更换为以95%空气＋5%CO2混合气体饱和的高糖、含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃孵箱（含95%空气＋5%CO2）中复氧3h。

1.4 实验分组 将培养的心肌细胞随机分4组。正常对照组（C组）：37℃孵箱中持续孵育4h，未经缺氧／复氧处理；缺氧／复氧损伤模型组（H／R组）：给予培养的心肌细胞单纯缺氧1h，复氧3h。缺氧／复氧＋低剂量SFI组（SFI－L组）：在缺氧前30 min加入终浓度为50μmol／mL的SFI，再缺氧1h／复氧3h；缺氧／复氧＋高剂量SFI组（SFI－H组）：在缺氧前30min加入终浓度为100μmol／mL的SFI，再缺氧1h，复氧3h。

1.5 观察指标

1.5.1 上清液肌酸激酶同工酶（CK－MB）、心肌肌钙蛋白I（cTn－I）含量测定 复氧末取细胞上清培养液，置－20℃ 冰箱保存批量待测。分别由Beckman DXC800全自动生化分析仪测定CK－MB含量，化学免疫发光法检测cTn－I含量。

1.5.2 心肌细胞MDA含量和SOD活性的检测 用硫代巴比妥法（TBA）测定MDA含量，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.5.3 心肌细胞凋亡率测定 采用流式细胞仪检测75%胰蛋白酶消化贴壁心肌细胞，消化分离后收集到试管中离心10min（1 000r／min），将细胞悬液用1mL空针抽吸两遍制成单细胞悬液，悬于70%冷乙醇（4℃）过夜。检测时离心10 min（1 000r／min），PBS洗去乙醇。细胞沉淀用PI 4℃避光染色30min，上机检测。G期前的亚二倍体峰即代表凋亡峰，反映凋亡细胞的百分比。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，两两间比较应用SNK－q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

与C组比较，H／R组心肌细胞培养液CK－MB、cTn－I含量、心肌细胞内MDA含量以及凋亡指数显著上升，SOD活性显著下降 （P＜0.01）。与 H／R 组 比 较，SFI－L 组、SFI－H 组 中除SOD活性显著上升外，上述其他指标均显著下降（P＜0.01）。SFI－L组和SFI－H组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 各组CK－MB、cTn－I、MDA含量、SOD活性及凋亡指数比较（±s）

表1 各组CK－MB、cTn－I、MDA含量、SOD活性及凋亡指数比较（±s）

组别 n CK－MB（U／L） cTn－I（ng／mL） MDA（nmol／L） SOD（nU／mL） 凋亡指数（%）C组 10 1.20±0.43 0.012±0.007 6.29±0.91 26.37±2.86 3.11±0.45 H／R组 10 10.38±2.411） 0.901±0.0141） 21.76±2.631） 13.12±3.111） 20.22±3.241）SFI－L组 10 5.25±1.401）2） 0.465±0.0221）2） 15.47±1.631）2） 19.22±2.051）2） 8.66±1.251）2）SFI－H组 10 4.63±1.251）2） 0.431±0.0181）2） 14.10±1.421）2） 21.05±2.331）2） 7.46±1.441）2）与C组比较，1）P＜0.01；与 H／R组比较，2）P＜0.01

3 讨 论

本研究所用SFI为临床常用针剂型，结合以往研究及预实验结果，选择SFI浓度为50μmol／mL和100μmol／mL进行实验[4，5]。CK－MB和cTn－I正常情况下存在于心肌细胞内，当心肌细胞受损或坏死后就溢出胞外，释放水平愈高，则代表细胞损伤坏死愈重，是反映心肌损伤的特异性和敏感性均较高的指标[6，7]。本研究结果显示，H／R组上清液CK－MB、cTn－I含量以及心肌细胞凋亡指数均较C组明显升高，表明心肌细胞H／R损伤模型制备成功。

从结果可以看出，SFI组上清液CK－MB、cTn－I含量以及心肌细胞凋亡指数均较H／R组显著下降，表明SFI可通过减少CK－MB和cTn－I的释放，抑制心肌细胞凋亡，对H／R损伤心肌细胞产生保护作用。心肌细胞H／R损伤发生机制尚未完全阐明，目前认为主要通过黄嘌呤氧化酶途径产生大量氧自由基聚集，介导膜脂质过氧化反应，使细胞膜流动性和通透性增加，完整性丧失，膜对离子转运功能障碍，Na＋、K＋、Ca2＋等离子在细胞膜内外分布异常致心肌细胞严重肿胀，线粒体功能受损，氧利用率降低。大量Ca2＋涌入细胞导致Ca2＋超载，通过加速黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，促使氧自由基增多，进一步加重再灌注损伤[8，9]。MDA是氧自由基致脂质过氧化的中间代谢产物，可反映细胞机体内脂质过氧化程度，间接反映细胞受氧自由基攻击的严重程度，SOD可清除机体内超氧自由基，保护细胞，因而SOD高低可间接反映机体清除氧自由基的能力[10，11]。本研究结果显示，H／R可引起心肌细胞 MDA水平明显上升而SOD活性明显下降（P＜0.01），SFI则能显著抑制H／R所致的MDA水平上升和SOD活性下降（P＜0.01），说明SFI是通过减少氧自由基产生，抑制机体内脂质过氧化程度，从而对心肌细胞产生保护作用。本研究中SFI选用了两组浓度，结果显示增加SFI浓度后心肌保护作用的增强并不具统计学意义。

综上所述，SFI能显著降低原代培养心肌细胞CK－MB、cTn－I含量，抑制心肌细胞凋亡，对心肌H／R损伤产生保护作用，其机制可能与提高心肌细胞SOD活性，减少MDA生成量，减轻脂质过氧化反应有关。

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