DNA聚合酶含量对目的基因扩增的影响＊

陕西中医学院第二附属医院 （咸阳712000） 李 宏 田亚宁 董昌虎梁 漫 王 蕾 齐 婧 仝航斌 周智辉

目前，随着分子生物学技术的快速发展，PCR技术广泛应用于医学研究领域，除在科研方面的贡献巨大之外，对于临床疾病的诊断和预后评估方面具有重要的应用价值。本文着重从PCR反应体系的1个关键因素：Taq DNA聚合酶含量进行实验研究，寻求最佳的Taq DNA聚合酶PCR反应条件。Taq DNA聚合酶是 Mg2＋依赖性酶，因而对 Mg2＋的浓度最为敏感，在PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性与反应体系中游离Mg2＋浓度直接相关，反应体系中Mg2＋浓度低时，酶的活力显著降低；过高时，酶则催化非特异性扩增。因此，在固定其他因素的前提下，探讨两者最佳作用浓度，从而提高Taq DNA聚合酶的作用效力，以获得理想的目的基因的扩增片断。

材料与方法

1 材 料 实验标本：收集50份正常人的静脉血，EDTA抗凝。主要仪器及设备：低温冰箱、低温超速离心机、PCR扩增仪、凝胶成像系统。主要试剂：Taq DNA聚合酶（MBI），Marker（100bp－1500bp，广州东胜），25 m M MgCl2（MBI），琼脂糖（Spanish Specifications）。

2 方 法 ①DNA的提取：采用经典的酚－氯仿－异戊醇法：在室温下融化血液，混匀后吸取0．6 ml至离心管中，加入3～5倍体积的红细胞裂解液（含KHCO3、 NH4Cl、EDTA－Na2），轻柔混匀，冰中放置30 min，中间上下颠倒，轻柔混匀数次。5000rp m 10 min，弃上清收集细胞。加入1 ml红细胞裂解液，混匀，冰中静置10 min。5000r p m 10 min，弃上清收集细胞。重复前两步，直到沉淀中肉眼可见之红色。用150μl的 白 细 胞 裂 解 （含 10 m MTris－Cl p H－8．0，100 m M Na Cl，10 m MEDTA，0．5%SDS，0．1 mg/ml蛋白酶K）液悬浮沉淀，置于37℃水浴中过夜。加入等体积的饱和酚，充分混匀，以12000r/min离心10 min，将上清液移至另一EP管中。加入等体积的氯仿：异戊 醇 （24 ∶ 1）［1］，充 分 混 匀，以 12000r/min 离 心10 min。去上层水相，加入1/10体积的3 MNa AC，2倍体积的冰乙醇，混匀后放置在－20℃静置1h。以12000r/min离心10 min，小心弃上清。70%的乙醇洗涤两次，以12000r/min离心5 min，弃上清，室温干燥15 min。TE缓冲液溶解DNA，使其A260/280的比值界于1．65～1．80之间，－20℃保存待用。②PCR反应体系的设立及PCR扩增：PCR反应体系总体积固定在常用的50μl，DNA模板采用同一个样本（浓度：50ng/μl）1μl，10×Taq buff er：5μl，10 m Md NTP：1μl，上下游引物各1μl（浓度为：50μmol/L），引物使用HLA微卫星引物：MIB（位于：HLA－B基因着丝粒点25 Kb处），上游引物序列：MIB－1：5＇CTA CCA TGA CCC CCT TCC CC3′，下游引物序列：MIB－2：5＇CCA CAG TCT CTA TCA GTC CA3′［2］，扩增产物大小范围为：326bp。PCR扩增参数：预变性95℃5 min；变性52℃1 min，延伸72℃1 min，共35个循环；终延伸72℃10 min。每次PCR反应均设立空白对照。固定25 m M Mg Cl2的含量为：3μl，通过设立不同的 Taq DNA聚合酶（浓度为5u/μl）的含量进行PCR反应，每个含量级重复PCR反应10次，并进行严格的质量控制，Taq DNA 聚合酶的含量梯度依次为：0．2μl，0．3μl，0．4μl，0．5μl，0．6μl，0．65μl，0．75μl，0．8μl，0．85μl，0．9μl，0．95μl，1μl；并在1%琼脂糖凝胶电泳上进行检测。Taq DNA聚合酶（浓度为5u/μl）的含量由0．2～1μl。固定 Taq DNA聚合酶（浓度为5u/μl）的含量为：0．5μl，通过设立不同的25 m M Mg Cl2含量梯度进行PCR反应，每个含量重复PCR反应10次，并进行严格的质量控制，25 m M Mg Cl2含量梯度依次为：1μl，1．5μl，2μl，2．5μl，3μl，3．5μl，4μl，扩增产物的质量通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

结 果

使用经典的酚－氯仿－异戊醇法提取的DNA模板纯度高，基因组DNA质量完好，无蛋白质和酚等杂质残留，适合PCR反应。扩增产物大小在326～356bp范围之内，符合引物设计要求，即为所要扩增的目的基因片断。在固定25 m M Mg Cl2的含量为3μl时，Taq DNA聚合酶（浓度为5u/μl）的含量分别为0．4μl、0．5μl时，PCR扩增效果较好，条代清楚，无脱尾现象，当其含量大于0．5μl时，出现非特异行扩增条带；其余均未出现阳性扩增条带（包括空白对照组）。当Taq DNA聚合酶的含量为0．5μl，25 m M Mg Cl2含量分别为2μl、2．5μl、3μl时PCR扩增效果较好，条带清楚，在2．5μl和3μl时，有微量拖带现象。表明 Taq DNA聚合酶的含量稍微过量，造成非特异性扩增。固定 Taq DNA聚合酶（浓度为5u/μl）的含量为：0．5μl，不同的25 m M Mg Cl2含量梯度进行PCR反应后经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见附图。

附图 琼脂糖凝胶电泳检测结果

讨 论

用于PCR反应的模板DNA是PCR扩增得以成功的前提［3］，酚－氯仿－异戊醇法是一种经典的方法，提取的DNA纯度较高，所获得的DNA片断相对完整适于PCR分析以及基因多态性的研究［4］。本实验采用酚－氯仿－异戊醇法所提取的DNA经紫外分光光度计检测A260/280比值在1．65～1．80之间，电泳检测如附图所见，质量较高，完全符合PCR反应对模板DNA的要求。在固定 Mg Cl2的含量为：3μl时，Taq DNA聚合酶的含量在0．4μl与0．5μl能够得到完好的扩增产物，Taq DNA聚合酶的含量在0．6μl时虽然出现条带，但属于非特异性扩增，拖尾拖带现象非常明显，造成此现象的原因有：酶量过多或酶的质量差，d NTP浓度过高，Mg2＋浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起；本实验排除其他原因，分析出现本实验出现拖带现象的主要因素是DNA聚合酶过量。当固定Taq DNA聚合酶的含量为：0．5μl时，Mg Cl2含量分别在2μl、2．5μl、3μl时出现清晰完整的扩增条带。但仔细观察发现在第6、7泳道的扩增产物条带亮度较强，并且稍有拖尾，不是很明显，说明Mg2＋的量相对较多。用2μl的25 m M Mg Cl2和0．5μl的Taq DNA聚合酶（5u/μl）反复扩增多次，电泳检测发现条带规整无拖尾。PCR反应体系是多因素的体系，要考虑到各个因素，对PCR体系不断的优化，必须固定其中的一两个因素后进行大量的实验研究才能很好的完善，更好的应用于临床疾病的分子诊断及预后评估。

［1］Mer k S，Meyer H，Greiser－Wilke I，et al．Detection of Bur kholderia cepacia DNA fro m Artificially Infected EDTA－blood and Lung Tissue Co mparing Different DNA I－solation Methods［J］．J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2006，53（6）：281－285．

［2］Gri maldi MC，Clayton J，Pontarotti P，et al．New highly poly morphic microsatellite marker in linkage disequilibriu m with HLA－B［J］．Hu m Immunol，1996，51（2）：89－94．

［3］Sikorsky JA，Pri merano DA，Fenger T W，et al．DNA da mage reduces Taq DNA poly merase fidelity and PCR amplification efficiency［J］．Biochemical and Biophysical Research Co mmunications，2007，355（2）：431－437．

［4］Turgut S，Yaren A，Kursunluoglu R，et al．MDR1 C3435 T poly mor phis m in patients with breast cancer［J］．Arch Med Res，2007，38（5）：539－544．