4种核酸染料在实验教学中的应用研究

孟超敏+李雪林+王丽峥+马占强

摘 要：分别使用4种核酸染料对凝胶中质粒DNA进行染色，紫外凝胶成像仪下观察和记录结果，比较4种核酸染料对琼脂糖凝胶中DNA的染色效果，并对结果进行比较分析。结果表明，EB价格低廉，对含量为50ng以上的DNA着色效果最好，亮度较暗；而Gold view与EB相比染色效果无太大差别，但是亮度比EB稍亮；Sybr green在这4种核酸染料中亮度很明显，且对含量为10ng以上的DNA就有荧光呈现；Ultra power对含量为5ng以上的DNA染色效果明显，亮度最亮。由于EB有强致突变性，微毒，而后3种核酸染料基本无毒性，安全可靠，因此，本着经济、方便、可靠的原则，在实验室中用Gold view足以满足一般需要；经济允许且在做荧光定量PCR、即时PCR时，最好选用Sybr green。

关键词：实验教学；核酸染料；琼脂糖；凝胶电泳

中图分类号 Q812；S336 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）08-21-03

Application of Four Nucleic Acid Dyes in Experiment Instruction

Meng Chaomin et al.

（College of Agriculture，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

Abstract：DNA of plasmid was stained with four nucleic acid dyes.The staining results were investigated under UV transilluminator.The results show that，the EB price is low，the content is the best DNA coloring effect than 50NG，brightness is dark； and no significant difference between Gold view and EB dyeing effect，but a bit brighter brighter than EB； Sybr green in these four kinds of nucleic acid dye brightness obviously，and there are fluorescent presentation of the content of more than 10NG DNA； Ultra power on the content of 5ng or DNA staining effect is obvious，the most bright brightness.And because EB has strong mutagenicity，micro toxic； the latter three nucleic acid dye is nontoxic，safe and reliable.To sum up，in line with economic，convenient，reliable principle，in the laboratory using Gold view is sufficient to meet the general needs； and in the economy allows fluorescence Quantitative PCR，real-time PCR，the best selection of Sybr green.

Key words：Experiment instruction；Nucleic acid dye；Agarose；Gel electrophoresis

溴化乙锭（EB）是目前分子生物学实验室核酸凝胶电泳中使用最普遍的染料，被广泛用于观察检测核酸，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点[1-2]。但由于EB是一种强诱变剂，具有高致癌性[3]，对实验者和周围环境都有着较大的危害，因此，寻找可靠并更安全的核酸染料就成为了实验者迫切需要解决的问题。本文对4种常见的核酸荧光染料Gold view、Sybr green、Ultra power、EB对琼脂糖凝胶中DNA的染色效果、染色特性和可靠性进行比较分析，从而为核酸荧光染料的选择，以及保障实验人员的安全性、环境保护等方面提供参考。

1 主要材料、试剂与仪器

1.1 主要材料与试剂 含Pcambia1301型质粒的大肠杆菌，溴化乙锭，Gold view，Sybr green，Ultra power，其余试剂为国产分析纯。

1.2 仪器 紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司），电子天平（BL610，北京赛多利斯天平有限公司），电泳仪（DYY-7型，北京市六一仪器厂），紫外凝胶成像系统（Tanon1600型），高速冷冻离心机（3K15型）。

2 试验方法

2.1 质粒DNA的提取并进行质粒DNA纯度和浓度测定 参照文献[4]的方法小量提取质粒，取出100μL的质粒DNA，加入2 900μL的无菌蒸馏水，配成3mL的质粒DNA。用蒸馏水作对照，测定样品在260nm和280nm波长下的光密度吸收值，每个样品重复3次，取3次结果的平均值作为最终结果，换算出OD260/OD280的比值。根据双链DNA1OD260nm=50μg，计算出样品DNA的浓度，计算公式为所测的OD260nm×50/10（μg/μL）。经计算可得该次稀释后的质粒DNA浓度为10μg/mL。标记为①号质粒DNA（表1）。

2.2 质粒DNA的稀释 （1）用10μL量程的移液枪吸取5μl的①号质粒DNA，再加入45μL的无菌蒸馏水，即成②号质粒DNA，该DNA浓度为1μg/mL。（2）用10μL量程的移液枪吸取5μL的②号质粒DNA，再加入45μL的无菌蒸馏水，即成③号质粒DNA，该DNA浓度为0.1μg/mL。

2.3 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 灌制4块浓度为0.8%琼脂糖凝胶，当琼脂糖凝胶溶液冷却至60℃分别在4份琼脂糖凝胶溶液中加入2μL的EB、2μL的Gold view、2μL的Sybr green、2μL的Ultra power，轻轻混匀倒胶。在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，使上样缓冲液的最终稀释倍数达到1倍。分别用微量移液枪吸取：10μL的DNA③、2μL的DNA②、5μL的DNA②、10μL的DNA②、2μL的DNA①、5μL的DNA①、10μL的DNA①与适量的上样缓冲液混合。设置不同的DNA含量梯度为1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、50ng、100ng。并用10μL的移液枪将上述浓度的DNA样品按次序加入2～8号点样孔中进行琼脂糖凝胶电泳分离。

表1 不同含量的DNA的吸光度

[浓度

（μg/mL）＼&吸光度＼&Ⅰ＼&Ⅱ＼&Ⅲ＼&平均＼&100＼&2.103＼&1.985＼&1.912＼&2.000＼&50＼&1.212＼&0.987＼&0.801＼&1.000＼&20＼&0.396＼&0.399＼&0.405＼&0.400＼&10＼&0.214＼&0.198＼&0.224＼&0.200＼&5＼&0.102＼&0.107＼&0.091＼&0.100＼&2＼&0.031＼&0.044＼&0.045＼&0.040＼&1＼&0.023＼&0.019＼&0.018＼&0.020＼&]

2.4 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 灌制4块浓度为0.8%琼脂糖凝胶，当琼脂糖凝胶溶液冷却至60℃时，分别在4份琼脂糖凝胶溶液中加入2μL的EB、2μL的Gold view、2μL的Sybr green、2μL的Ultra power，轻轻混匀倒胶。在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，使上样缓冲液的最终稀释倍数达到1倍。分别用微量移液枪吸取：10μL的DNA③、2μL的DNA②、5μL的DNA②、10μL的DNA②、2μL的DNA①、5μL的DNA①、10μL的DNA①与适量的上样缓冲液混合。设置不同的DNA含量梯度为1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、50ng、100ng。并用10μL的移液枪将上述浓度的DNA样品按次序加入2～8号点样孔中进行琼脂糖凝胶电泳分离。

3 结果与分析

经琼脂糖凝胶电泳后，将2组凝胶板分别置于紫外凝胶成像仪下，可观察到4组胶板中的DNA样品条带（见图1～图4）。由图1～图4可以看出：Ultra power染色的条带最亮，并且能检测出5～100ng的DNA含量，且50ng/带以上的样品条带清晰，有拖尾现象（如图4）；Sybr green亮度次之，并且能检测出含量为10ng以上的DNA条带，但是在50ng/带以上的样品条带清晰（如图3）；Gold view的亮度再次之，对含量为50ng以上的DNA染色效果明显，条带清晰（如图2）；EB的亮度最低，同样对含量为50ng以上的DNA染色效果明显（如图1）；Gold view和Ultra power有少许的扫尾现象（如图3，图4）。根据各种不同的核酸染料在灵敏度、毒性、致癌性、荧光显色等方面的综合比较，3种新型核酸染料完全可以替代EB，本着经济、方便、可靠的原则，在普通实验室中用Gold view即可满足一般实验需要。

[1][2][3][4][5][6][7]

图1 EB的染色结果

注：1～7号点样孔中DNA的含量分别为1、2、5、10、20、50、100ng/带。

[1][2][3][4][5][6][7]

图2 Gold view的染色结果

注：1～7号点样孔中DNA的含量分别为1、2、5、10、20、50、100ng/带。

[1][2][3][4][5][6][7]

图3 Sybr green的染色结果

注：1～7号点样孔中DNA的含量分别为1、2、5、10、20、50、100ng/带。

[1][2][3][4][5][6][7]

图4 Ultra power的染色结果

注：1～7号点样孔中DNA的含量分别为1、2、5、10、20、50、100ng/带。

4 结论与讨论

EB价格最廉，但有毒性，有潜在致癌性，因此实验结束后应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康，其与DNA结合在紫外灯下呈现红色荧光。Gold view价格较低，毒性很低，灵敏度和EB的相当，但不具有致癌性，在紫外灯下，Gold view染色使dsDNA呈现绿色荧光，而ssDNA呈红色荧光，因此能较好的区分dsDNA和ssDNA。而Sybr green和Ultra power 的价格较高，对与一般的实验室来说较为昂贵，但Sybr green和Ultra power的安全性更高，几乎为无毒[5]。Ultra power是一种新型的花菁染料，不影响其他修饰酶作用，但该核酸染料对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲和力，电泳时间也不宜超过2h，否则染料会从DNA/RNA上分离出来，会产生弥散装条带。Karlsen F等认为[6-10]Sybr green是近几年新推出的一种荧光核酸染料，在紫外灯下与dsDNA结合呈现绿色荧光，与ssDNA结合呈现橘黄色荧光，但检测ssDNA的灵敏度不高，效果不好，在荧光定量PCR、即时PCR方面应用有着不可取代的优点。可见，Gold view、Sybr green、Ultra power的3种染料的灵敏度均与EB基本相当，甚至高于EB，而且这3种新型核酸染料基本对人体无害，不具有强致癌性。在向相同浓度的琼脂糖凝胶中加入相同含量的4种核酸染料对相同的DNA样品进行电泳分析，可以看出4种核酸染料均能清晰检测出浓度在50ng/带的DNA样品。

参考文献

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[3]刘阳，杨淑霞，李敏惠，等.三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较[J].成都医学院学报，2008，3（1）：20-23.

[4]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].第2版.北京：中国协和医科大学出版社，1999：83-85，111-115.

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[6]张全渡，冉黎，陆长膏，等.四种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中染色特性的比较分析[J].四川解剖学杂志，2007，15（3）：29-30.

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（责编：张宏民）