巨大芽胞杆菌的产酶特性及发酵条件的研究

匡 群，陈秋红，孙 梅，张维娜，施大林，胡 凌，高 亮

(江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏 无锡 214063)

近年来，随着人们对健康和环境保护的高度重视，无公害、无残留的绿色微生态制剂成为研究的焦点，芽胞杆菌是微生态制剂的常用菌种，已广泛应用于医疗、保健、食品、畜牧和水产等行业。常用的芽胞杆菌微生物制剂菌种有枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、纳豆芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等。巨大芽胞杆菌是生产生物有机肥的常用菌种，也是制作水体处理剂的常用菌种，它能降解一些顽固的难降解的杀虫剂和土壤中的有机磷，可以用来生产解磷固钾肥，对环境具有十分重要的作用［1-2］。另外，一些巨大芽胞杆菌能产生具有抑菌作用的蛋白质，可进一步提纯抑菌蛋白作为农用抗生素，或者克隆其编码基因用于抗真菌病害转基因植物的研究等方面［3］。在工业上，巨大芽胞杆菌分泌的酶应用也十分广泛，如淀粉酶应用于面包生产、青霉素酰胺酶应用于合成新型人工抗生素等［4］。由于芽胞具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能经受多种逆境影响，使芽胞杆菌具有很好的应用前景，因此芽胞是制备微生态制剂和生防菌制剂的理想存在形式［5］。本文对1株巨大芽胞杆菌JSSW-JD的产胞外酶特性进行研究，并对其产芽胞发酵条件进行优化，为该菌株的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 巨大芽胞杆菌JSSW-JD由江苏省苏微微生物研究有限公司生化工程研究室筛选保藏。

1.1.2 培养基 ①斜面种子培养基:营养琼脂培养基;②摇瓶种子培养基:营养肉汤培养基;③摇瓶基础培养基(g/L):葡萄糖 10.0，蛋白胨 5.0，酵母膏5.0，NaCl 5.0，pH 7.0 ～7.2;④活菌及芽胞检测用培养基:PCA平板计数培养基;⑤淀粉水解培养基［6］(g/L):蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，牛肉膏3.0，可溶性淀粉2.0，琼脂粉 15.0 ～20.0，pH 7.0～7.2;⑥酪素培养基［6］:取5.0 g 脱脂奶粉加入到50.0 mL 蒸馏水中，另称 1.5 g 琼脂溶于 50.0 mL蒸馏水中，将两液分开灭菌，待冷却至45～50℃时，将两液混匀倒平板，即成酪素培养基平板;⑦纤维素培养基［7］(g/L):K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.25，CMC-Na 1.88，刚果红 0.2，琼脂 16.0，明胶 2.0，pH 7.0;⑧油脂水解培养基［7］(g/L):蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，牛肉膏3.0，植物油 10.0，1.6%中性红水溶液1.0 mL，琼脂粉 15.0 ～20.0，pH 7.2 ～7.4(培养基 pH 调好后再加入 1.6% 中性红溶液)。将灭菌后的油脂培养基充分震荡，使油脂分布均匀，以无菌操作制成平板。

1.1.3 试剂 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、硫酸铵、NaCl、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4、CaCO3、碘、碘化钾、中性红、刚果红，以上试剂均为国产分析纯试剂;蛋白胨、酵母膏为国产生化试剂;玉米淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉、豆粕粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉为市售。

1.1.4 仪器 YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器，上海三申医疗器械有限公司;GJ-202洁净工作台，无锡市新达净化成套设备厂;PYX-DHS-40X隔水式电热恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂;123MB-1型光学显微镜，Nikon;HYG-Ⅱa迴转式恒温调速摇瓶柜，上海欣蕊自动化设备有限公司;Delta320 pH计，梅特勒-托利多;DK-S24恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 ①种子培养:无菌开启菌株JSSW-JD的冻干保藏菌种，划线接种于营养琼脂试管斜面，30℃培养24～48 h，然后再转接1次活化，从转接的新鲜斜面种子中用接种环挑取1环菌泥接种至装液量为50 mL的500 mL三角瓶中，30℃，200 r/min，回转摇床振动培养24～48 h;②摇瓶培养:将新鲜的种子液以5%的接种量接入摇瓶培养基，250 mL三角瓶装液体积为25 mL，30℃，200 r/min的回转摇床培养48 h;③扩大培养:a.100 L种子罐培养:按摇瓶培养所获得的最佳培养基和培养条件，于100 L种子罐中进行培养，种子罐的装液体积为65% ～70%(体积比)，加消泡剂0.05%，搅拌转速200 r/min，空气流量4 m3/h，培养24 h;b.2 m3发酵罐培养:按摇瓶优化条件上罐，种子培养液以体积比5%的接种量接入2 m3发酵罐，发酵罐装液体积为65%～70%(体积比)，加消泡剂0.05%，搅拌转速100～120 r/min，空气流量60 m3/h，30℃培养40～48 h，取发酵液进行镜检，当90%以上的菌体已形成芽胞时，即放罐结束培养。

1.2.2 测定方法 ①活菌总数的测定［6］:以倾注法进行活菌计数;②芽胞浓度的测定［8］:菌液于80℃水浴加热15 min，杀死营养体细胞，采用倾注法进行芽胞计数;③芽胞率计算公式:芽胞率%=(芽胞数/活菌总数)×100%。

1.2.3 产酶特性测定［7，9］①淀粉酶检测:将种子液点种于淀粉水解培养基上，每种菌液作3个重复，30℃培养24～48 h，将培养好的平板取出，滴加少量的卢哥氏碘液均匀覆盖于培养基上，稍停片刻，观察其菌落周围形成的透明圈，测量菌落和透明圈的直径，取其平均值，用公式Up=(D/d)2来表示水解能力的大小，D为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)，Up值越大，说明淀粉酶产酶能力越强;②蛋白酶检测:将种子液点种于酪素平板培养基上，每种菌液作3个重复，30℃培养24～48 h，观察记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明，测量菌落和透明圈的直径，取其平均值，计算出透明圈直径与菌落直径之比，同样用公式Up=(D/d)2来表示水解能力的大小，Up值越大，说明蛋白酶产酶能力越强;③纤维素酶检测:将种子液点种于纤维素培养基上，每种菌液作3个重复，30℃培养24～48 h，在平板上出现透明圈的菌落为纤维素分解菌，具有产纤维素酶的能力，测量菌落和透明圈的直径，取其平均值，同样用公式Up=(D/d)2来表示水解能力的大小，Up值越大，说明纤维素酶产酶能力越强;④脂肪酶检测:将种子液点种于脂肪酶培养基上，30℃培养24～48 h，取出平板，观察平板底部，出现红色小球则说明脂肪被水解，为阳性反应，记为“+”，否则为阴性，记为“－”，说明脂肪酶未被水解，结果见表1。

1.2.4 数据分析 试验数据采用EXCEL2003进行处理，正交设计助手Ⅱ V3.1专业版软件进行正交试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 产酶特性测定结果

实验结果表明，JSSW-JD在淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶鉴别培养基上均产生分解圈，且随着培养时间的增长，分解圈增大，24 h透明圈与菌落面积比分别为 2.76、1.95、11.11，产酶能力由大到小依次是纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶，48 h透明圈与菌落大小比分别为 3.87、4.38、31.42，产酶能力由大到小依次是纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶;而脂肪酶鉴别培养基平板底部，未出现红色小球，则说明脂肪未被水解，结果见表1。

表1 产酶特性测定结果Table 1 Results of enzyme production characteristics

2.2 发酵培养基优化

2.2.1 单因素试验 ①碳源对菌株生长的影响:分别以10.0 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、玉米淀粉、红薯淀粉作为基础培养基的碳源，基础培养基中其它成分不变，30℃，200 r/min，恒温摇床振荡培养48 h后，进行计数，结果见图1。从图1结果可以看出，巨大芽胞杆菌JSSW-JD对糖类、淀粉碳源都能利用，在葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为碳源的培养基中培养48 h获得的菌体数及芽胞数均不高;而在玉米淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉为碳源的培养基中培养48 h，获得的菌体数及芽胞数均较糖类碳源高，综合考虑最终获得的菌体数及芽胞数，玉米淀粉为最高，因此选择玉米淀粉作为碳源;②氮源对菌株生长的影响:分别以10.0 g/L的蛋白胨、玉米浆干粉、黄豆饼粉、酵母膏、豆粕粉、硫酸铵作为基础培养基的氮源，基础培养基中其他成分不变，30℃，200 r/min，恒温摇床振荡培养48 h后，进行计数，结果见图2。从图2可以看出:菌株JSSW-JD对有机氮源的利用率较高，以豆粕粉、酵母膏、玉米浆干粉作为氮源可获得较高的菌体数和芽胞数;对无机氮源硫酸铵的利用较差，菌体数很低，且不形成芽胞。以豆粕粉作为氮源，最终获得的菌体数及芽胞数均为最高，且豆粕粉作为氮源发酵成本较为经济，因此选择豆粕粉作为氮源;③无机盐对菌株生长的影响:以玉米淀粉为碳源，豆粕粉为氮源，在基础培养基中分别添加2.00 g/L 的 ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4及CaCO3，且以不添加无机盐的处理组作为对照，30℃，200 r/min，恒温摇床振荡培养48 h后，进行计数。结果见图 3，其中K2HPO4、CaCO3对菌株生长及芽胞形成有促进作用，ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O对菌株生长及芽胞形成影响不大，因此可考虑在培养基中添加K2HPO4、CaCO3以促进菌株生长及芽胞形成。

图1 不同碳源对菌株JSSW-JD生长的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on growth of Bacillus megaterium JSSW-JD

图2 不同氮源对菌株JSSW-JD生长的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources on growth of Bacillus megaterium JSSW-JD

图3 不同无机盐对菌株JSSW-JD生长的影响Fig.3 Effect of different inorganic salts on growth of Bacillus megaterium JSSW-JD

2.2.2 培养基正交试验 根据单因素试验的结果，选用最佳碳源玉米淀粉、最佳氮源豆粕粉及无机盐K2HPO4、CaCO3共4个因素，采用L9(34)正交试验因素水平表进行培养基优化试验(表2)。试验结果与分析见表3、表4。

表2 培养基浓度正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels table of medium concentration orthogonal test

表3 培养基浓度正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of medium concentration

由表3中数据直观分析得知，各因素极差大小为RA＞RB＞RD＞RC，培养基中影响芽胞数的各因素主次为A＞B＞D＞C，主要影响因子为玉米淀粉，其次为豆粕粉，K2HPO4和CaCO3对结果影响较小。根据方差分析(表4)，玉米淀粉、豆粕粉在α=0.05水平上对实验结果的影响存在显著性差异，最佳的组合是A2B2C3D3。但是在正交试验表中没有此组合，需进行验证试验。正交设计表中的试验5为相近组合且在正交试验中该组芽胞数最高，为此选试验5与最佳组合的培养基进行验证。结果显示，最佳组合芽胞数达1.5×109cfu/mL，而试验5芽胞数为1.1×109cfu/mL。因此，优化后的培养基为玉米淀粉10.0 g/L，豆粕粉10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，CaCO32.0 g/L。

表4 培养基浓度方差分析表Table 4 Analysis of variance table of medium concentration

2.3 发酵培养条件优化

得出优化的培养基之后，利用正交试验研究pH值、温度、接种量、装液量对菌株生长及芽胞形成的影响，采用L9(34)正交表进行培养条件优化试验(表5)。以上试验每处理均重复3次，结果见表6、表7。对表6中数据直观分析得知，各因素极差大小为RD＞RB＞RA＞RC，培养条件中影响芽胞数的各因素主次为D＞B＞A＞C，主要影响因子为装液量，其次为培养温度，pH和接种量对结果影响较小。根据方差分析(表7)，装液量在α=0.05水平上对实验结果的影响存在显著性差异，在摇瓶发酵中，装液量直接影响通气量即溶氧，装液量小即通气量大可促进芽胞形成。最佳的组合是A2B2C3D1，此最佳组合也在试验设计中，即试验5，培养48 h，芽胞数为1.7×109cfu/mL，因此培养条件的最佳组合为初始pH 7.0，250 mL三角瓶装液体积为25 mL，接种量5.0%，培养温度30℃。

表5 培养条件正交试验因素水平表Table 5 Factors and levels table of culture condition orthogonal test

表6 培养条件正交试验结果Table 6 Orthogonal test results of culture condition

表7 培养条件方差分析表Table 7 Analysis of variance table of culture condition

2.4 2 m3发酵罐扩大培养试验

根据上述优化试验结果，在2 m3发酵罐进行巨大芽胞杆菌的扩大培养试验，发酵罐装液体积为65% ～70%(体积比)，种子培养液以体积比5%的接种量接入2 m3发酵罐，加消泡剂0.05%，搅拌转速100～120 r/min，空气流量60 m3/h，30℃培养48 h，试验结果见图4。接种后4 h内芽胞迅速萌发成生长旺盛的营养菌体;约8 h，菌体结束迟滞期，随后进入指数期，生长旺盛，24 h左右就已结束对数生长期，进入平衡期，菌体浓度逐渐达到最高值3.9×109cfu/mL;在平衡期的中后期，菌体开始形成芽胞，芽胞率逐渐上升，培养40 h后，镜检可见芽胞成熟脱落，44 h芽胞计数达峰值3.8×109cfu/mL，芽胞率97.4%;44 h 后菌体进入衰亡期，菌体开始自溶，芽胞有失活迹象，芽胞数、芽胞率均有所下降，培养结束。因此，应在培养40 h后，镜检观察芽胞成熟情况，及时判断培养终点。上述试验结果表明，巨大芽胞杆菌JSSW-JD在2 m3发酵罐中扩大培养效果良好，可将上述试验获得的最佳培养条件进一步应用于工业化大规模生产。

图4 2 m3发酵罐培养曲线Fig.4 Time course of the cultivation in 2 m3fermentation tank

3 讨论

本试验通过对巨大芽胞杆菌JSSW-JD的产胞外酶特性的研究显示，JSSW-JD在淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶鉴别培养基上均产生分解圈，且随着培养时间的增长，分解圈增大，表明JSSW-JD具有较强的产胞外淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的能力，它的这一特性使其对有机物具有良好的分解能力，在提高饲料蛋白质和能量的利用率以及改善水体、土壤生态环境方面具有潜在的应用价值。

由于芽胞具有较强的抗逆性，在制备微生态制剂及生防菌制剂时，有利于产品的活性保持及保存运输。因此，如何获得高浓度的芽胞，对巨大芽胞杆菌的培养具有较大的实用意义。目前已有一些关于巨大芽胞杆菌发酵培养的报道，如:陈凯等［1］采用单因子实验及正交试验优化了巨大芽胞杆菌P1菌株的最佳发酵条件，并在10 L发酵罐上进行了发酵条件验证，菌数达到6.0×109cfu/mL，芽胞比率达90%以上。郭晓军等［10］通过摇瓶培养对毛竹枯梢病拮抗细菌巨大芽胞杆菌6-59菌株芽胞形成的发酵培养基和培养条件进行优化，在试验获得的优化条件下，6-59菌株发酵液中的芽胞数量为2.0×109cfu/mL，芽胞形成率达96.4%。本试验为了获得高浓度的芽胞，分别对巨大芽胞杆菌JSSW-JD的发酵培养基及培养条件进行了优化，优化后的最佳培养基组成为玉米淀粉10.0 g/L，豆粕粉10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，CaCO32.0 g/L。培养条件的最佳组合为初始 pH 7.0，250 mL三角瓶装液体积为 25 mL，接种量5.0%，培养温度30℃。根据摇瓶试验获得的优化条件在2 m3发酵罐中扩大培养，培养44 h，菌体浓度达3.9 ×109cfu/mL，芽胞浓度达 3.8×109cfu/mL，芽胞率97.4%。本试验获得芽胞数量、芽胞率均达到或高于上述研究报道水平，且经2 m3发酵罐扩大培养试验验证，效果良好，扩大培养高于摇瓶培养水平。此外，本试验获得的最佳培养条件，发酵主要原料为玉米淀粉、豆粕粉，营养要求比较低、来源广、成本低，因此可进一步应用于工业化大规模生产。

巨大芽胞杆菌是1株很有潜力的生防菌株，已被越来越多地应用于农业生产中，本试验仅对巨大芽胞杆菌JSSW-JD的产胞外酶特性进行了研究，下一步将深入研究其在植物病虫害防治及土壤生态环境改善等方面的作用机理，如解磷作用和抑菌作用等。

［1］陈凯，李纪顺，杨合同，等.巨大芽胞杆菌P1的解磷效果与发酵条件研究［J］.中国土壤与肥料，2010，(4):73-76.

［2］杨艳，刘萍，马鹏飞，等.巨大芽胞杆菌MPF-906对养鱼水质净化的初步研究［J］.水产养殖，2007，28(3):6-8.

［3］曹燕鲁，吴琼，刘矫.巨大芽胞杆菌B1301分泌物的抑菌作用及其特性的研究［J］.山东轻工业学院学报，2004，18(2):51-55.

［4］牟琳，王红宁，邹立扣.巨大芽胞杆菌表达外源蛋白的特点及其研究进展［J］.中国生物工程杂志，2008，28(4):93-97.

［5］徐世荣，陈骧，吴云鹏.细菌芽胞形成机制在微生态制剂生产中的应用［J］.食品与生物技术学报，2007，26(4):121-126.

［6］周德庆.微生物实验手册［M］.上海:上海科学技术出版社，1986:81-82，144，153.

［7］吴海龙.食物垃圾高效降解功能菌株的筛选、鉴定及其优化组配［D］.硕士学位论文.杭州:浙江大学，2008:37-40.

［8］杜连祥.工业微生物学实验技术［M］.天津:天津科学技术出版社，1992:104.

［9］张念海，易安妮，丛莉，等.侧孢芽胞杆菌2002的培养特性及发酵条件优化［J］.食品研究与开发，2011，32(3):152-156.

［10］郭晓军，李潞滨，李术娜，等.毛竹枯梢病拮抗细菌巨大芽胞杆菌6-59菌株的产芽胞条件优化［J］.植物保护学报，2008，35(5):443-447.