影响茶花炭疽病孢子萌发与附着胞形成的因子

路 梅，叶美娟，凌丹燕，陈文荣

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

茶花炭疽病是茶花主要病害之一，由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起，病症多出现于叶缘、叶尖和叶脉两侧。初现暗绿色斑纹，后逐渐扩大成不规则大斑，颜色由褐色变为黑色，严重时可扩散到整个叶片，引起大量落叶。该病害在浙江省金华地区普遍发生，严重影响茶花的观赏和经济价值。胶孢炭疽菌可以引起百余种植物发生炭疽病，主要危害叶片和果实，国内外每年都有很多相关研究报道［1-2］，然而，对茶花炭疽病的研究却鲜有报道。关于该病菌的侵染过程，目前研究一致认为，胶孢炭疽菌的分生孢子先附着于寄主表面，条件适合，产生芽管，继而在其顶端形成附着胞，随后侵入寄主表皮细胞［1］。因此，分生孢子萌发率和附着胞形成率的高低成为病原菌侵染寄主成功与否的关键。本文将报道实验室内影响茶花炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的主要因子，为进一步阐明病害的发生规律和制定有效的防治措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

茶花炭疽病菌株(C.gloeosporioides)由浙江师范大学分子生物学实验室提供。

1.2 方法

将菌种接种于PDA培养基中，置于25℃生化培养箱中培养5 d，产孢备用。采用“载玻片法”进行孢子的萌发［3］。具体方法如下:在直径9 cm的培养皿内放置1层滤纸，吸取无菌水将滤纸浸湿，上面放2根玻璃棒，载玻片架在玻璃棒上;将200 μL各种溶液配制的孢子悬浮液(1×105～1×106个/mL)滴在载玻片上，于25℃培养箱中培养;分别在8、12、24 h后取出观察，计算孢子萌发率和附着胞形成率(孢子萌发率=已萌发的孢子数/总孢子数;附着胞百分率=附着胞数/孢子萌发数)［1］。

1.2.1 不同碳氮源对分生孢子萌发和附着胞形成的影响 分别用0.5%的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和硫酸铵、草酸铵、酵母提取物、蛋白胨和硝酸铵溶液配制孢子悬浮液，用Eppendorf移液器分别移取200 μL孢子悬浮液滴于载玻片上，其他试验处理同上。

1.2.2 不同pH值对分生孢子萌发和附着胞形成的影响 分别用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl溶液配制 pH 值分别为 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13共11种孢子悬浮液，其他试验处理同1.2.1。

1.2.3 温度对分生孢子萌发和附着胞形成的影响 用蒸馏水配制1×105～1×106个/mL孢子悬浮液，培养温度设置为 10、15、20、25、30、35、40℃，观察温度对分生孢子萌发和附着胞形成的影响。

1.2.4 光照对分生孢子萌发和附着胞形成的影响 设置连续光照、12 h明12 h暗、12 h暗12 h明、完全黑暗、自然光照5种光照条件，用蒸馏水配制1×105～1×106个/mL孢子悬浮液，其他试验处理同 1.2.1。

1.2.5 数据分析 以上所有试验中，每个处理设4个重复，每组试验重复3次。采用Spss和Excel 2007软件对实验所得数据进行数据处理和图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同碳氮源对炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的影响

图1显示不同碳氮源对炭疽菌孢子萌发的影响。由图1可知，随着培养时间的延长，不同处理的孢子萌发率都幅度不同的增加;培养12 h内，不同碳源对孢子萌发率的影响不显著(P＞0.05);在24 h，影响显著(P ＜0.05);供试4 种碳源中，葡萄糖处理的孢子萌发率始终高于其他碳源，培养24 h后差异显著，结果说明葡萄糖能促进孢子的萌发。氮源对茶花炭疽菌孢子的萌发影响研究显示，分生孢子在草酸铵和硝酸铵中几乎不萌发;在硫酸铵中少有萌发;在酵母提取物中萌发率最高，蛋白胨仅次之。结果说明，酵母提取物能够显著促进孢子的萌发。

图1 不同碳氮源对炭疽菌孢子萌发的影响Fig.1 The impact of different carbon and sources on anthrax spore germination

不同碳源对附着胞形成影响试验中，前12 h内所有处理中均未检测到附着胞;24 h时，检测到少量的附着胞，麦芽糖、乳糖、葡萄糖和蔗糖处理附着胞的形成率分别为 6.06%、2.16%、1.67%和3.51%，差异不显著(P ＞0.05)。结果说明，不同的碳源中附着胞的形成需要至少培养12 h以上。而对不同氮源的研究发现，硫酸铵、草酸铵、酵母提取物、蛋白胨和硝酸铵5种氮源处理样品中，24 h内均未检测到附着胞的形成，说明5种供试氮源均抑制附着胞的形成。

2.2 不同pH对炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的影响

图2显示，分生孢子在pH 5～10的溶液中萌发，在pH 3和pH 4的溶液中极少萌发，在pH 11和pH 12的溶液中不萌发;在相同时间内，分生孢子的萌发率在不同的pH溶液中呈正态分布，以pH 7为中点向两端呈递减趋势，萌发率逐渐减小。不同pH对炭疽菌附着胞萌发影响试验显示(未附图)，培养8 h时，未见附着胞;12 h时，在pH 7～10溶液中，检测到少量的附着胞，形成率均为0.937%;24 h时，pH 5～10溶液中，附着胞形成率为 4.62%、18.54%、6.65%、16.76%、16.59%和14.09%，差异显著。不同pH值对分生孢子萌发和附着胞形成影响的结果说明，偏酸性的环境有利于孢子的萌发和附着胞形成。但是，孢子萌发和附着胞形成所需的最适pH值略有不同。

图2 不同pH对炭疽菌孢子萌发的影响Fig.2 The impact of different pH on anthrax spore germination

2.3 不同温度、光照对炭疽菌孢子萌发和附着胞形成的影响

不同温度对分生孢子萌发的影响试验显示(图3)，10℃与40℃处理下，孢子不萌发;在相同时间内，20℃处理的孢子萌发率最高。在24 h时，孢子的萌发率由前面的散乱趋向正态分布，不同温度处理下孢子的萌发率差异显著;20℃处理的孢子萌发率与其他处理差异显著，但与25、30、35℃差异不显著。温度对附着胞形成影响研究发现，附着胞形成所需的最适温度同为20℃。研究还发现，20℃处理12 h，孢子的萌发率为53.29%(图3)，附着胞形成率为16.27%(图4);24 h，孢子的萌发率为60.67%(图3)，附着胞形成率为52.88%(图4)，说明在最适温度20℃条件下，附着胞的形成滞后于孢子的萌发;且随着培养时间的延长，附着胞的形成率快速提高，而孢子的萌发率增长较少。

图3 不同温度对炭疽菌孢子萌发的影响Fig.3 The impact of different temperature on anthrax spore germination

图4 不同温度对炭疽菌附着胞形成的影响Fig.4 The impact of different humidity on appressorium formation of colletotrichum

图5显示5种不同光照条件对炭疽菌孢子萌发的影响。由图5可知，随着培养时间的延长，各处理孢子的萌发率升高。培养24 h后，12 h光照12 h黑暗处理的孢子萌发率最高，与其他处理差异显著。由此可见，茶花炭疽菌孢子萌发的最佳光照条件为先进行12 h光照培养再进行12 h黑暗处理。

图5 不同光照对炭疽菌孢子萌发的影响Fig.5 The impact of different illumination on anthrax spore germination

图6显示不同光照条件对炭疽菌附着胞形成的影响。由图6可知，在不同光照条件下培养8 h，全黑暗、自然光和12 h黑暗12 h光照3种处理下，均未检测到附着胞;全光照和12 h光照12 h黑暗处理下只检测到极少量的附着胞。12 h时，全光照和自然光条件下附着胞形成率较高;24 h时，自然光照条件下，附着胞形成率最高，全光照和全黑暗条件下附着胞形成率次之。黑暗光照的交替处理对附着胞形成也有一定的影响。首先，在12 h光照条件下，附着胞形成较低;进入12 h黑暗培养后，附着胞形成率有所提高，但是数值并不显著。其次，先进行12 h黑暗培养，几乎不形成附着胞;转入12 h光照条件后，附着胞形成率显著提高。

图6 不同光照对炭疽菌附着胞形成的影响Fig.6 The impact of different illumination on appressorium formation of colletotrichum

2.4 茶花炭疽菌孢子萌发和附着胞形成显微照片

茶花炭疽菌分生孢子单细胞，长圆筒形或长椭圆形，两端钝圆，无色，大小为(150～35)μm×(80 ～35)μm，平均 115.5 μm ×57.5 μm。分生孢子萌发时在孢子中部形成1～2个隔膜，从每个细胞长出1个芽管，芽管顶端形成附着胞。附着胞，圆形，大小平均约60 μm。在薄PDA平板、强光照、温度适宜的条件下2～3个月后长出呈放射状扇形的分生孢子器，其分支明显有隔膜，分生孢子从分生孢子器上单个长出，为无性繁殖阶段。茶花炭疽菌形态特征显微照片见图7所示。

图7 茶花炭疽菌形态特征显微照片Fig.7 Morphological characteristics micrograph of C.gloeosporioide of camellia

3 讨论

胶孢炭疽菌(C.glosporioides Penz)是引起植物炭疽病的一类重要植物病原真菌，此菌能引起叶斑、果腐、嫩梢或枝条回枯等症状，寄主范围十分广泛，给农业生产造成严重的经济损失。本研究首次对碳源、氮源、温度和光照等条件因子对茶花胶孢炭疽菌分生孢子萌发和附着胞形成的影响进行了系统研究。研究发现，所供试的9种碳氮源中，葡萄糖和酵母提取物能显著促进孢子萌发，这与柿树和佛手炭疽菌的研究结果一致［1，4-5］;硫酸铵等5种氮源在24 h内对附着胞形成的抑制作用明显，目前为止尚未见类似报道，其机理还需进一步的试验研究。茶花生长适温在20～25℃，性喜偏酸的土壤。研究还发现，孢子萌发和附着胞形成适宜的温度和pH与茶花生长所需要的温度和pH基本一致。由此推测，寄主生长习性符合于病原物的生长周期要求，并且经过长时间的进化，两者呈趋同的趋势，对海巴戟炭疽病的研究也验证了该推测［6］;周而勋等［7］因此建议可在冷凉季节大力发展菜心生产而避开高温高湿的夏季，以减轻菜心炭疽病的发生和危害。因此，趋同趋势可能是炭疽菌对农业生产造成严重经济损失的重要原因，破坏其生长周期可以减少相应的损失。

本研究是在实验室内进行的体外试验，需进一步的致病性试验验证，其结果可能存在一定的差异。张敬泽等［1］研究发现，致病性试验显示柿树炭疽病原菌引起病害所要求的pH范围比体外试验结果要窄，暗示了寄主表面微环境可能具有缓冲一定范围的能力;也有报道［8］，pH能够调节病原真菌果胶酸盐裂解酶基因的表达或活性，从而促进对寄主的危害。此外，附着胞的形成是炭疽菌成功侵染的关键，有研究报道［7］含疏水基的植物表面、营养饥饿或洋葱表皮细胞表面可以刺激附着胞形成。茶花炭疽菌是否也存在上述情况，有待于进一步的研究探索。

［1］张敬泽，胡东维.影响柿树炭疽菌孢子萌发、附着胞形成及致病性的环境因子［J］.植物生理学报，2004，34(2):154-161.

［2］王卫芳，冷怀琼.柑桔炭疽病菌潜伏侵染的研究、分生孢子萌发和附着胞形成［J］.四川农业大学学报，1991，9(2):200-205.

［3］方中达.植病研究方法［M］.北京:中国农业出版社，2007，152-153.

［4］Estrada A B，Dodd J C，Jeffries P.Effect of humidity and temperature on conidial germination and apperssorium development of two Philippine isolates of the mango anthracnose pathogen Colletotrichum gloeosporioides［J］.Plant Pathology，2000，49(5):608-618.

［5］路梅，杨佳妮，周端顼，等.佛手炭疽病病原菌生物学特性研究［J］.浙江师范大学学报，2011，34(3):323-327.

［6］蔡志英，刘昌芬，蓝增全，等.西双版纳海巴戟炭疽病和病原菌分生孢子萌发、附着胞形成条件的研究［J］.植物保护，2009，35(1):90-93.

［7］周而勋，杨媚，张华，等.菜心炭疽病菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响因素［J］.南京农业大学学报，2002，25(2):47-51.

［8］Yakoby N.Kobiler I，Dinoor A，et al.pH regulation of pectate lyase secretion modulates the attack of Colletotrichum gloeosporioides on avocado fruits［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2000，66(3):1026-1030.