中国红树植物角果木内生真菌的分离及其初步鉴定

古海刚，白红进，曾艳波，常东东，梅文莉*

(1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔 843300;2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海南 海口 571101)

中国红树植物角果木(Ceriops tagal)是红树科(Rhizophoraceae)角果木属(Ceriops)的常绿植物，别名剪子树、海枷仔、海淀子(海南)［1］。该科约有16属120余种，分布于全世界的热带地区，我国有6属13种1变种，产于西南至东南部，而以南部海滩为多。近年来，角果木的药用价值得到国内外学者的重视，Anjaneyulu等［2-4］从同属植物C.decandra中分离到kaurene和gibberellin类型8个新的二萜类化合物，张炎等［5］从角果木(C.tagal)石油醚部分分离出2种Dolabrane型二萜，其中一种为 Tagalsins A。相关研究已证实Tagalsins 系列化合物具有膜通透性和广谱的杀肿瘤活性，可以杀伤多种人类肿瘤细胞，具备新药开发价值［6］。在我国民间，本属植物用以止痛［7］，角果木的树皮捣碎可以止血、收敛、通便和治疗恶疮;种子榨油可以止痒、治疥癣，也可以治冻疮;叶煎汁曾作奎宁替代品治疟疾［8］。在印度，角果木树皮熬汁也用于治疗恶疮和止血［9］。从内生真菌与寄主植物同步演化关系推测［10］，内生真菌有可能产生与宿主植物相同或具有相似生理活性的代谢产物，角果木内生真菌的代谢产物可能含有二萜类化合物及其衍生物。由于不少二萜含氧衍生物具有很好的生物活性，如穿心莲内酯、雷公藤内酯、银杏内酯等，有些已是临床常用的药物［11］，而二萜类化合物的提取纯化工艺尚不成熟，存在溶剂、能源消耗大且效率不高的问题［12］。巨大的临床需求与有限的天然资源的矛盾激发人们不断寻找新的药用资源。植物内生真菌作为一类应用前景广阔的资源微生物正受到越来越多的关注。从近年来的研究看，植物体中存在内生真菌是普遍的［10］。本文首次对中国红树植物角果木的树根、枝和叶进行内生真菌的分离鉴定，希望从中筛选到生物活性成分的菌株，并探讨中国红树植物角果木内生真菌的分布情况、多样性及其组织偏好性，旨在丰富真菌资源、为中国红树植物角果木保护性开发利用及新的药用资源开发提供基础的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 来源 中国红树植物角果木健康的树根、枝、叶，于2011年7月采自海拔最低的自然保护区—海南东寨港红树林自然保护区，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所代正福副研究员鉴定。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，其中分离培养基中添加氯霉素(25 U/mL)和链霉素(50 U/mL)抑制细菌生长。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离和纯化 取中国红树植物角果木健康的树根、枝、叶，洗净晾干后在无菌条件下用75%乙醇浸泡30 s，无菌水漂洗3次，再用5%有效氯含量的次氯酸钠浸泡5～8 min(叶片5 min，根、枝8 min)，无菌水漂洗5次，无菌滤纸吸干水分后备用。将树叶切成0.5 cm×0.5 cm的小块，将根、枝切去两端，并切成1 cm左右的小段，根、枝和叶各随机选取40块(段)作为供试角果木组织块，共计120块。将切好的样品接入新鲜的加有氯霉素和链霉素的PDA培养基，置26℃培养箱中培养3～21 d。每日定时观察内生真菌长出情况，待切口处长出菌丝，即转接至新鲜PDA培养基，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化直至获得纯菌株。最后再转接到PDA平板培养基，26℃培养箱中倒置暗培养8周，供观察保藏用［13-14］。同时做对照实验:将表面消毒后的树根、枝、叶不作切割置相同条件下培养，结果无任何微生物长出，证明表面消毒彻底，分离到的真菌是中国红树植物角果木的内生真菌。

1.2.2 内生真菌的分类鉴定和保藏 采用经典的形态方法进行内生真菌鉴定，根据内生真菌主要的菌落形态特点(包括菌落大小、颜色、表面特征、质地)和孢子大小、颜色、形状和产孢结构类型等显微特征，参考文献［15-16］对其分类地位进行了鉴定，经过产孢诱导培养后仍不能产孢的菌株归为不产孢类群(Mycelia Sterilia);PDA试管斜面保藏于－4℃冰箱，每3个月转接1次。

2 结果与分析

2.1 内生真菌分离

实验发现，120个供试中国红树植物角果木植物组织块中有78个被内生真菌侵染(根28个，枝16个，叶34个)，从中分离获得95株内生真菌，其中从树叶分离到的内生真菌最多，共73株，根和枝分离到的内生真菌分别为13株和9株。经计算得出(表1)，中国红树植物角果木内生真菌总的分离率为79.2%，根、枝、叶分离率分别为10.8%、7.5%、60.8%;总内生真菌的定殖率为65.0%，根、枝、叶定殖率分别为 23.3%、13.3%、28.3%。可见，中国红树植物角果木树叶的内生真菌丰富度要明显高于根和枝。

表1 中国红树植物角果木内生真菌的分离率和定殖率Table 1 Isolation rate and colonization rate of endophytic fungi from mangrove plant Ceriops tagal

2.2 初步形态学鉴定

从中国红树植物角果木植物中共分离获得95株内生真菌。经菌落特征与显微形态观察，鉴定为2纲、2目、4科、14属，将其中94株归为半知菌类，另1株在PDA固体培养基上长出子实体，将其归为担子菌纲。将半知菌类产孢的28株鉴定为13个属，以青霉属(Penicillium sp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)和枝顶孢霉属(Acremonium sp.)为优势种群;未产孢的66株暂定为无孢菌群。另1株在PDA固体培养基上长出子实体，将其归为担子菌纲。初步的鉴定结果见表2，部分真菌的菌落特征与显微形态特征见图1与表3。

表2 中国红树植物角果木内生真菌的种群、数量与种类分布Table 2 Quantity，genera and composition of endophytic fungi from mangrove plant Ceriops tagal

表3 中国红树植物角果木内生真菌形态特征描述Table 3 Description about morphological characters of endophytic fungi from the mangrove plant Ceriops tagal

2.3 统计分析

初步形态学鉴定结果表明(表2)，中国红树植物角果木内生真菌产孢的28株分属于13个属，其中青霉属(Penicillium sp.)8株、镰孢霉属(Fusarium sp.)5 株、枝顶孢霉属(Acremonium sp.)4 株，相对频率分别为28.6%、17.9%和14.3%，为中国红树植物角果木内生真菌的优势种群，显示出该植物内生真菌在种类和数量上存在着极其丰富的多样性特征。这3属为中国红树植物角果木内生真菌的优势属，占总数的60.8%。色疣节梗孢属(Conatobotryum sp.)有 2株，占7.1%。拟青霉属(Paecilomyces sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、地霉属(Geotrichum sp.)、帚梗柱孢属(Cylindrocladium sp.)、树粉孢属(Oidiodendron sp.)、拟小卵孢属(Ovulariopsis sp.)、双孢束梗孢属(Didymostilbe sp.)、芽枝霉属(Cladosporium sp.)和拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.)均只有1 株，只占3.6%。中国红树植物角果木树叶所分离的内生真菌与其根、枝相比，无论在数量上还是在种群组成上都有较大差异。从树叶分离到的73株(占菌株数的76.84%)内生真菌，对13株产孢的内生真菌进行鉴定，涉及半知菌类的9个属(占13个属的69.23%)，其中青霉属为优势种群，共5株，占叶部的6.85%;有13株从根部获得(占菌株数的13.68%)，所鉴定的产孢10株内生真菌涉及6个属(占13个属的46.15%)，其中镰孢霉属为优势种群，共4株，占根部的30.77%，枝顶孢霉属为亚优势种群，有2株，占根部的15.38%;其余9株在枝部获得(占菌株数的9.47%)，所鉴定的产孢6株内生真菌涉及半知菌类的4个属(占30.77%)，其中青霉属为优势种群，共 2株，占枝部的22.22%，曲霉属、枝顶孢霉属(Acremonium sp.)和拟盘多毛孢属各有1株，还涉及1株担子菌(Basidiomycetes)。中国红树植物角果木内生真菌多样性指数为2.20，其中根、枝、叶内生真菌多样性指数分别为 0.94、0.55 和1.26。不同部位间内生真菌相似性系数分别为0.462(根 vs枝)、0.588(根vs叶)和0.375(枝vs叶)。拟青霉属、树粉孢属、拟小卵孢属、双孢束梗孢属、芽枝霉属共5个属只在叶部分离得到;地霉属、帚梗柱孢属共2个属只在根部分离得到;而曲霉属、拟盘多毛孢属仅在枝部有分布。

图1 中国红树植物角果木内生真菌菌落及显微形态照片Fig.1 Photoes of colony and microscopical morphological characters of endophytic fungi from the mangrove plant Ceriops tagal

3 讨论

本研究表明，中国红树植物角果木的树根、枝、叶均有内生真菌存在，不仅在组织部位而且在属的水平上均具有一定的专一性。在不同部位都具有不同种类的内生真菌的分布，呈现出种类多样性特征。各部位既含有各自特有的专一性菌群也含有共有的广布菌群，根、叶间的相似性较高，而根、枝及枝、叶间相似性偏低，体现出一定的组织差异性和专一性，各部位多样性指数的差别也可以充分体现出明显的组织差异性。造成这种专一性和差异性的原因可能是各器官和组织含有的营养物质不同、组织结构不同和不同季节环境因素(降水量、气温、湿度、光照强度等)的变化影响［17］，还有可能是由于内生真菌为了在小生境中生存，因竞争而形成的一种选择性机制。特别是环境因素中降水的变化，改变了植物组织的内环境，进而影响了内生真菌的定居和分布。由于中国红树植物角果木生长于热带、亚热带海区潮间带，雨季较多，长期处于高温高湿环境中，这种生活环境的特殊性造成不同部位的微环境如化学成分、通气状况和酶的不同，影响了内生真菌的侵染、分布。

通过对中国红树植物角果木内生真菌多样性研究可以更好地探讨各器官和组织与内生真菌分布的关系，获得了丰富的内生真菌资源，并首次从中国红树植物角果木植物中分离到拟盘多毛孢属，当前此属产生的次生代谢产物已成为国际研究热点［18］，深入研究植物内生拟盘多毛孢与植物共生机理，对探明该类真菌在自然生态系统中的作用是十分必要的。本研究为内生真菌中新的生物活性物质的提取和筛选、植物病虫害防治和新药物的研制等工作提供理论依据。有关中国红树植物角果木内生真菌中活性菌株的筛选、天然活性化合物的化学成分研究，将在随后的文章中给予报道研究。

［1］陈焕镛.海南植物志［M］.北京:科学出版社，1964:220.

［2］Anjaneyulu ASR，Rao VL.Ceriopsins A-D，diterpenoids from Ceriops decandra［J］.Phytochemistry，2002，60(8):777-782.

［3］Ammanamanchi SR，Anjaneyulu，vadalilr，et al.A new diterpenoid ceriopsins E from Ceriops decandra［J］.J Nat Prod，2002，65(4):592-594.

［4］Anjaneyulu ASR，Rao VL.Ceriopsins F and G，Diterpenoids from Ceriops decandra［J］.Phytochemistry，2003，62(8):1207-1211.

［5］张炎，邓志威，高天翔，等.中国红树植物角果木的化学成分［J］.药学学报，2005，40(10):935-939.

［6］林文翰，陈英玉，顾佳，等.Tagalsin C及其同系物在制备抗肿瘤药物中的应用［P］.中国:200610081051.7，2007-11-28.

［7］Lin P，Fu Q.Environmental Ecology and Economic Utilization of Mangroves in China［M］.Beijing:China Higher Education and Springer-Verlag Press，2000:1-15.

［8］LIN P.The medicinal mangrove plants from China［J］.Chinese Journal of Marine Drugs，1984，3(4):45-51.

［9］Rastogi RP，Mehrotra BN.Compendium of Indian Medicinal Plants［M］.New Delhi:Publications and Information Directorate，1991:311.

［10］郭良栋.内生真菌研究进展［J］.菌物系统，2001，20(1):148-152.

［11］匡海学.中药化学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:181.

［12］韦纬，金日显，陈燕军.二萜类化合物的提取与纯化工艺研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2007，13(12):66-70.

［13］Guo LD，Hyde KD，Liew ECY.Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences［J］.New Phytol，2000，147(3):617-630.

［14］范黎，郭顺星，曹文芩，等.墨兰共生真菌—新种的分离、培养、鉴定及其生物活性［J］.菌物系统，1996，15(4):251-255.

［15］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海:上海科学技术出版社，1982.

［16］巴尼特HL，亨特BB.沈崇尧译.半知菌属图解［M］.北京:北京科学出版社，1977.

［17］胡克兴，侯晓强，郭顺星.铁皮石斛内生真菌分布［J］.微生物学通报，2010，37(1):37-42.

［18］韦继光，徐同.植物内生拟盘多毛孢的生物多样性［J］.生物多样性，2003，11(2):162-168.