响应面法优化趋磁细菌AMB-1产磁小体的条件

陶玉贵，孙忆晨，曹 宁，葛 飞

(安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

磁性纳米颗粒作为一种纳米材料在生物技术和生物制药等领域已显出良好的应用前景［1］，如生物活性物质的固定和修饰，靶向药物以及生物活性物质的检测等［2-3］。合成生物相容磁性纳米微粒的方法主要有共沉淀法［4］、气溶胶法［5］、微乳液法［6］等。但是物理或化学方法制备的磁性纳米颗粒尺寸分布较宽、在溶液中易发生聚集，使其失去纳米材料所特有的性质［7］。因此，通过生物方法得到粒径分布范围窄、操作简单和成本低的磁性纳米颗粒是人们关注的重点［8］。趋磁细菌是一类能够将环境中铁元素矿化为积累在细胞内由生物膜包被的、纳米尺寸、单磁畴级别晶体颗粒的微生物［9］，由该方法得到磁性纳米颗粒能够很好地满足较窄的粒径分布范围等要求［10-11］，是一种非常理想的纳米载体［12］。目前的研究表明，大多数趋磁细菌需要在微好氧或厌氧条件下生长，且营养条件要求苛刻［13］，因此在实验室中能够分离纯化得到的细菌种类很少，限制了对其的进一步研究。Magnetospirillum sp.AMB-1是 Matsunaga等［14］从日本东京天然淡水泉沉积物中分离得到的1株螺旋形趋磁细菌，是目前为数不多的几种能在实验室条件下大量培养的细菌，其耐氧度高，能够利用三羧酸循环的中间体作为生长所需的碳源，并可在微好氧或厌氧条件下合成Fe3O4型磁小体。但由于其所需的生长条件较为苛刻，因此，大量的纯种培养及合成较多的磁小体仍然是目前亟待解决的问题［15］。本文在前期所做的单因素实验基础上，利用响应面法优化趋磁细菌Magnetospirillum sp.AMB-1产磁小体的条件，所有的实验设计、数据处理以及响应面模型的建立均使用SAS软件进行。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 趋磁细菌 Magnetospirillum sp.AMB-1，购于美国标准菌种保藏所，菌种编号为ATCC700264。

1.1.2 培养基 活化培养基和种子培养基，均为MSGM 培养基［16］。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 ①平板培养:将趋磁细菌Magnetospirillum sp.AMB-1进行平板培养，30℃条件下培养96 h;②种子培养:250 mL锥形瓶中装入种子培养基125 mL，接入平板培养基上的细菌，30℃下培养4 d;③发酵培养:通过调节培养基中营养成分的添加量，于250 mL锥形瓶中装入125 mL培养基，并按2%的接种量，在不同培养条件下依次进行Plackett-Burman、最陡爬坡实验和响应面实验。

1.2.3 实验设计 ①Plackett-Burman实验:根据单因素实验结果，选取6个影响因素，进行8次实验，并对其重要性进行筛选(自变量、编码和水平因素见表1);②最陡爬坡实验:根据Plackett-Burman实验结果设计最陡爬坡路径，增加或减少重要因素在培养基中的浓度，其余因素均为初始水平，考察发酵液中菌体量与磁小体形成量的变化趋势，确定重要因素的最适浓度范围［18-19］;③Box-Behnken实验:以Plackett-Burman实验筛选得到的对发酵液中菌体量和磁小体形成量影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡实验得到的最佳条件为中心点，根据相应的实验表进行实验，使用SAS软件对实验结果进行响应面分析(见表2)。

表1 Plackett-Burman实验因素与水平Table 1 The two levels of variables used in the Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken实验因素与水平Table 2 Levels of variables used in the Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman 实验

Plackett-Burman实验结果见表3，并采用SAS软件对表3中的菌种量和磁小体形成量进行回归分析，得到各影响因素的偏回归系数及其显著性(见表4)。实验结果表明，奎尼酸铁添加量、培养温度和pH值对菌种浓度影响较大，且影响均为正效应。而pH和培养温度对磁小体形成量并无太大影响，奎尼酸铁添加量对其影响呈现正效应。根据实验结果综合考虑，选择奎尼酸铁添加量、pH和温度进行进一步的优化。

表3 Plackett-Burman实验设计结果Table 3 Plackett-Burman experimental design and response values

表4 偏回归系数及影响因子的显著性分析Table 4 Partial regression coefficients and analysis of their significances

2.2 最陡爬坡实验确定最佳浓度范围

如表5所示，在奎尼酸铁添加量为 0.25 μmol，培养温度为32℃，pH为6.7的实验条件下，趋磁细菌量和磁小体形成量均达到最大值，以该实验条件作为中心点，进行下一步优化实验。

表5 最陡爬坡路径实验设计及结果Table 5 The path of steepest ascent experimental design and response values

2.3 利用响应面分析法确定最佳实验条件

以奎尼酸铁添加量、培养温度和pH 3个重要因素为自变量，各个因素水平见表2，Box-Behnken实验设计及结果如表6所示。

表6 Box-Behnken实验设计及结果Table 6 Box-Behnken experimental design and response values

根据表6的实验结果，利用SAS软件处理后得到回归方程。菌种浓度的回归方程:Y1=0.974667+0.00025 × A+0.005375 × B-0.00375×C-0.008208×A ×A+0.0005×A ×B+0.0025×A ×C-0.022458×B ×B-0.00325×B ×C-0.039458×C ×C

磁小体形成量的回归方程:Y1=1.782333+0.0035 × A+0.004375 × B-0.003875 × C-0.003417×A×A+0.00075 ×A ×B+0.00125×A×C-0.017667×B ×B-0.0025×B ×C-0.050167×C ×C。

其中A、B、C分别代表奎尼酸铁添加量、pH值和培养温度(表7)。方差分析显著性结果表明，R2分别为99.62%和99.03%，方程的回归性显著。

表7 回归分析结果Table 7 Results of regression equation analysis

利用SAS软件对回归模型进行响应面分析，得到各响应面立体分析图(图1，图2)。对上述2个回归方程求偏导，得到模型极值点，综合考虑后取奎尼酸铁添加量、培养温度和pH分别为2.7 μmol，32 ℃和 6.8，该条件下菌体浓度和磁小体形成量达到最大值。

图1 因素对菌体浓度交互影响三维曲面图Fig.1 Surface of mutual-influence on the yield of magnetotacic bacteria AMB-1

图2 因素对磁小体形成量交互影响三维曲面图Fig.2 Surface of mutual-influence on the production of magnetosomes

2.4 优化结果验证

为了验证模型的正确性，在预测的最佳培养条件下进行了3次发酵实验，所得的菌体浓度和磁小体形成量分别为 0.980 À、1.782，与预测值接近，说明该模型能够很好地预测其发酵情况。

3 讨论

采用响应面分析法对趋磁细菌产磁小体的条件进行优化，首先运用Plackett-Burman法确定出奎尼酸铁添加量、初始pH和培养温度为重要影响因素，然后通过最陡爬坡实验逐步改变三者的浓度，逼近最佳响应面区域;最后采用Box-Behnken设计及SAS软件分析确定除了主要影响因素的最佳浓度，得到最佳发酵培养条件为奎尼酸铁添加量 2.7 μmol、培养温度 32℃ 和 pH 6.8。同时进行了实验验证，通过回归方程所得到的最大预测值与验证值非常接近，说明该回归方程能够比较真实地反映各筛选因素对培养条件的影响，由此方法建立的模型与实际情况比较吻合，从对Cmag值测定的结果表明Cmag值与菌体浓度存在一定的关系，当菌体浓度增加时，单位发酵液中所含有的磁小体量也有一定程度的增加，因此用响应面法优化趋磁细菌产磁小体条件是可行的。

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