汉坦病毒76-118株M2基因的克隆及蛋白表达

王美莲，刘 兵，史俊岩，郑兰艳，罗恩杰

(中国医科大学病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110001)

汉坦病毒(hantaan virus，HV)属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，由其引起的人类肾综合症出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是一类以发热、出血和肾功能损伤为特征的急性传染病，病死率达0.1% ～10%［1］。病毒不仅可以直接引起全身小血管和毛细血管损伤、血管通透性增加和微循环障碍，还可引起免疫应答异常，进而引发高热、出血及肾损害等临床症状。汉坦病毒主要编码基因由S、L、M 3条单链负股RNA组成，它们分别编码汉坦病毒核蛋白、RNA聚合酶、糖蛋白，而含M基因的重组体DNA可诱导产生中和抗体，并且对病毒株的攻击有保护力。目前研究者已经对核蛋白的作用作了较深入的研究［2-3］。但对糖蛋白的研究相对较少。汉坦病毒M2基因上含有较多的抗原决定簇，因此如果可以大量的人工合成并提取G2蛋白对汉坦病毒糖蛋白单克隆抗体的研究及应用有重要的意义。本实验以原核表达质粒pGEX-6P-1为载体，构建了含有汉坦病毒76-118株编码囊膜糖蛋白G2抗原基因片段的原核表达载体pGEX-6P-1-M2，通过研究其在原核细胞中的表达，探讨汉坦病毒糖蛋白在筛选单克隆抗体及研制试剂盒中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 原核表达载体pGEX-6P-1、汉坦病毒76-118 株 M 片段、E.coli DH5α、E.coli BL21为本教研室保存。

1.1.2 引物的设计与合成 引物参照GenBank设计，由沈阳博奥春天生物公司设计并合成。序列如下:上游引物:5'-CGTGTTACCGGACACTAA-3'，BamHⅠ酶切位点;下游引物:5'-CCGAGTCACAGAATTTAGC-3'，XhoⅠ 酶 切位点。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶 EcoRⅠ及T4DNA连接酶、DL 15000 DNA Marker、小量 DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、预染蛋白Marker购自大连TaKaRa公司;辣根过氧化物酶标记羊抗人抗体、琼脂糖购自BIOWEST公司。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白表达载体pGEX-6P-1/M2的构建 以汉坦病毒76-118株M基因为模板进行PCR反应，扩增得到含完整编码汉坦病毒G2蛋白基因M2的1600 bp DNA片段，凝胶回收后－20℃保存。

1.2.2 质粒pMD18-M2的构建 将上述PCR产物与T载体pMD18分别经XhoⅠ和BamHⅠ消化后，在连接酶的作用下16℃连接约16 h。连接产物10 μL转化入感受态大肠埃希菌DH5α，铺LB平板并加入氨卞青霉素(1 μg/mL)，37℃培养16 h;筛选阳性菌落扩增培养，以碱裂解法小量提取重组质粒后，储存于－20℃。

1.2.3 原核表达载体 pGEX-6P-1-M2的构建将重组质粒及原核表达载体pGEX-6P-1均用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后在T4DNA连接酶作用下于16℃连接约16 h。连接产物10 μL转化入感受态大肠埃希菌DH5α，铺LB平板并加入氨卞青霉素(1 μg/mL)，37 ℃培养16 h。

1.2.4 重组质粒的转化、筛选及鉴定 按常规方法，将连接后所得的重组子转化入感受态宿主菌E.coli BL-21，在含氨苄青霉素LB平板上铺板，37℃温箱过夜培养。第2天从平板上挑取菌落接种于含氨苄青霉素的5 mL LB液体培养基，37℃摇床震荡培养5 h，快速碱裂解法粗提质粒，－20℃保存。

1.2.5 重组蛋白GST-G2的诱导表达和纯化将含重组质粒pGEX-6P-1-M2的大肠埃希菌BL-21接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养过夜。次日将过夜培养物转接于1000 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，继续在37℃振荡培养约3 h。加入 IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，置37℃继续培养4 h，离心，收集菌体。加细菌裂解缓冲液超声裂解细菌，离心取上清，对融合蛋白进行亲和层析纯化。

1.2.6 SDS-PAGE电泳及 Western-Blot分析 取纯化后的蛋白产物进行SDS-PAGE电泳，1 h后，取下凝胶进行转印，PVDF膜经TBS液洗涤10 min后，封闭液封闭1 h，再以TTBS洗涤2次。加入用1∶200封闭液稀释的患者血清，4℃孵育过夜，经TBS、TTBS洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记二抗 37℃ 孵育 2 h，TTBS、TBS洗涤，DAB显色。

2 结果与分析

2.1 M2基因片段的扩增

经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见1条约1600 bp的特异性扩增区带，与预期结果一致(图1)。

图1 PCR产物M2的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products M2

2.2 pMD18-M2重组质粒的酶切鉴定

用EcoRⅤ和BamHⅠ双酶切质粒，酶切产物经1%琼脂糖电泳证明重组质粒带有相应的目的基因(图2)。质粒交由北京三博远志生物公司测序。将测序结果与GenBank中的M2核苷酸序列进行比较，同源性达98%，开放读码框正确。

图2 pMD18-M2重组质粒的酶切鉴定Fig.2 Results of recombinant plasmid pMD18-M2

2.3 pGEX-6P-1-M2重组质粒的酶切鉴定

从阳性克隆中提取重组质粒，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到4900 bp和1600 bp 2条带，表明M2基因已克隆于pGEX-6P-1载体中(图3)。

图3 pGEX-6P-1-M2重组质粒的酶切鉴定Fig.3 Results of recombinant plasmid pGEX-6P-1-M2

2.4 融合蛋白的诱导表达及纯化

SDS-PAGE电泳结果可见与预期融合蛋白分子量大小相符的蛋白条带(图4)。Western-Blot分析进一步表明该蛋白条带为GST-G2融合蛋白(图5)。

图4 pGEX-6P-1-M2重组菌的诱导表达及纯化SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE result of inducted expression and purification for recombined bacteria pGEX-6P-1-M2

图5 Western-Blot结果Fig.5 Result of Western-Blot

3 讨论

汉坦病毒糖蛋白由 G1、G2组成，其具有重要的生物学功能，除了能与细胞膜上受体黏附、融合之外，更重要的是具有诱导机体产生中和抗体的抗原决定簇。最近发现，包膜糖蛋白上亦含有 CTL的表位［4］。对抗糖蛋白G1或G2的单克隆抗体研究发现，只有识别糖蛋白G2的单克隆抗体能产生血凝抑制反应，体外具有中和病毒抗原活性，而针对核壳蛋白(NP)的单克隆抗体绝大多数无中和活性［5-6］。虽然人们普遍认为汉滩病毒G2上的抗原位点对空间结构和糖基化依赖性较大，但仍然存在一定的由一级结构决定的中和位点。

本研究以pGEX-6P-1为载体，以编码汉坦病毒G2蛋白的M2基因为目的基因，构建原核表达载体pGEX-6P-1/M2，酶切和序列分析结果表明成功构建原核表达载体pGEX-6P-1/M2。为了获得足够量的蛋白用以进一步的研究，选用简便、高效及生产成本低的原核表达系统载体pGEX-6P-1。表达载体一般分为原核和真核两大类，是外源基因在宿主细胞中进行蛋白表达的主要工具，是将克隆的外源基因在宿主细胞内表达成蛋白质的载体。原核表达载体系统包括大肠埃希菌和枯草杆菌系统等，真核表达载体系统包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞系统等［7］。大肠埃希菌表达系统使用最早也研究最多，并且其遗传背景相对比较清楚，使用安全、操作简便、周期短［8］。大肠埃希菌表达载体有非融合表达、融合表达、分泌表达、带纯化标签表达、带伴同蛋白表达和表面呈现表达等［9］。融合蛋白是将2个各自独立的基因，通过表达载体使之连接成一体，表达2种不同蛋白的融合体。融合表达具有多方面的优点:如防止包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，限制蛋白酶解和利于纯化［10-11］。近年来，融合蛋白表达系统的发展为E.coli中高效表达和纯化重组蛋白提供了极大方便，GST(glutathione stransferase)是目前成功的融合表达系统［12-15］。原核表达载体pGEX-6P-1具有:①含有tac启动子，可使被克隆的基因得到可诱导的高水平表达;②含有lac Iq基因，适用于任何大肠埃希菌宿主;③含有凝血酶或Xa因子蛋白酶识别位点，可使目的蛋白从表达的融合蛋白中达到分离纯化。SDS-PAGE电泳显示，经IPTG诱导的重组原核表达质粒pGEX-6P-1/M2在大肠埃希菌BL-21中获得了高效表达的融合蛋白，证明原核表达载体pGEX-6P-1适用于汉坦病毒M2基因的原核表达研究。

通过Western-Blot分析融合蛋白GST-G2，结果证实重组蛋白GST-G2具有抗原性。

总之，本研究中以原核表达载体pGEX-6P-1为载体，成功构建了汉坦病毒M2基因原核表达载体，并获得了高效表达的具有生物学活性的重组融合蛋白，为将来筛选汉坦病毒抗体库以及汉坦病毒早期诊断试剂盒的研制奠定了基础。

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