香梨树腐烂病菌分生孢子获取方法及萌发条件的研究

唐俊煜 王延芳 李春燕 苟 巧 谢 新 张王斌，2*

(1 塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 南疆农业有害生物综合治理重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)



香梨树腐烂病菌分生孢子获取方法及萌发条件的研究

唐俊煜1王延芳1李春燕1苟 巧1谢 新1张王斌1，2*

(1 塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)(2 南疆农业有害生物综合治理重点实验室， 新疆 阿拉尔 843300)

【目的】分生孢子在树木腐烂病菌传播过程中起着极其重要的作用，是进行病原菌研究的重要实验材料，获得形态和萌发率一致的分生孢子尤为重要。【方法】本研究采用不同方法获得病菌的分生孢子，置于不同环境条件下，测定其萌发率筛选最优获取方法和萌发条件。【结果】田间采集发病组织获得分生孢子较为容易但易被污染；接种发病枝条和30 %PBA培养基15d左右均可获得形态一致和萌发率较为一致的分生孢子。【结论】病菌分生孢子萌发最适温度为25 ℃、相对湿度100 %、pH为5.0～6.0、黑暗条件并需要一定的营养物质。

库尔勒香梨； 腐烂病菌； 分生孢子； 萌发

库尔勒香梨是我国优良的地方梨品种之一，已远销全国各地及东南亚等世界其他国家[1]，而近几年受天气等因素影响，梨树腐烂病频繁发生，自1967年以来库尔勒市香梨经历了6次腐烂病大流行，吴芳等于2011年5～8月在库尔勒市的香梨园调查病株率达100 %[2]，该病被人们视为梨树的“绝症”，一旦发生就会造成大量死树或毁园[3-5]。因进行病原鉴定、病害流行规律、防治技术等方面的研究都需要大量且整齐度均一的分生孢子作为研究实验材料，然而，目前有人做过苹果树腐烂病分生孢子获取方法的研究[6-9]，但关于此方面研究未见综合性报道 。因此本研究主要通过改变产孢基质进行诱导产孢实验，根据所获分生孢子大小，形态与萌发率等指标筛选能大量、迅速产孢的理想方法，并进行分生孢子萌发实验，确定生长整齐且萌发率高的最适条件。优化产孢条件，筛选出合适的产孢基质及生长整齐的分生孢子，确定分生孢子萌发的最适条件，为梨树腐烂病菌病原鉴定、病害流行规律、防治技术等方面的研究提供优质病原菌。

1 材料与方法

1.1 材料采集

1.1.1 病样采集

采集阿拉尔周边库尔勒香梨树木发病枝条或树皮，室温下保存备用。

1.1.2 供试菌

南疆农业有害生物综合治理重点实验室保存的腐烂病菌菌株，分离于阿拉尔周边库尔勒香梨树木发病枝条上。实验前在PDA平板上25 ℃培养4～5 d活化以备用。

1.2 分生孢子获取方法

1.2.1 田间发病组织获取

将带有腐烂病菌分生孢子角的枝条或树皮，或将带有分生孢子器的树皮置于产孢器中保湿培养，直到出现孢子角。挑取孢子角，将其均匀融在灭菌水，制成孢子悬浮液备用。

1.2.2 培养基获取

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂10 g、水1000 ml，灭菌备用。

30 % PBA培养基：梨树皮300 g、琼脂30 g、水1000 ml，灭菌备用。

将在PDA上活化的病菌打成直径5 mm的菌饼，分别接种于PDA平板培养基和30 % PBA培养基上，每个处理5次重复，用保鲜膜密封置于25 ℃培养。

1.2.3 接种枝条获取

将活化好的菌饼接种于处理好的梨树枝条上，置于加有5 ml无菌水的250 ml三角瓶中。将三角瓶放置在25 ℃条件下培养。

1.3 分生孢子萌发条件测定方法

1.3.1 温度对分生孢子萌发影响的测定

将获得的分生孢子制成分生孢子悬浮液，高倍镜(10×40)下每视野20～30个孢子。孢子悬浮液均匀涂在PDA平板上，设置5、10、15、20、25、30 、35和40 ℃ 8个处理，每个处理设3次重复。分别在12 h、24 h、36 h、48 h检查分生孢子萌发情况(检查时取培养皿上均匀分布的3个点切成1 cm2小块，放在载玻片上，在显微镜下检查孢子萌发情况。每个小块检查100个孢子[10]。

1.3.2 湿度对分生孢子萌发影响的测定

用不同浓度的硫酸溶液控制80 %、90 %、95 %和100 %的空气相对湿度，将PD液涂于灭菌的载玻片上，自然风干，再涂上孢子悬浮液，待风干后，置于各个不同相对湿度的环境中，3次重复，25 ℃黑暗恒温条件下培养，在12 h、24 h、36 h、48 h镜检，观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率。(检查方法同1.3.1)

1.3.3 pH对分生孢子萌发影响的测定

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将PDA培养基的pH值分别调至2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0，将孢子悬浮液均匀涂布于PDA培养基上，作3次重复，25 ℃黑暗条件下培养，在12 h、24 h、36 h、48 h镜检，观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率。(检查方法同1.3.1)

1.3.4 光照条件对分生孢子萌发影响的测定

孢子悬浮液均匀涂在PDA平板上，设置全光照、全黑和半光照半黑暗3个处理，每个处理作3次重复，25 ℃条件下培养，在6 h、12 h、18 h、24 h、30 h镜检，观察孢子萌发情况，计算萌发率。(检查方法同1.3.1)

1.3.5 营养条件对分生孢子萌发影响的测定

将分生孢子悬浮液分别凃于PDA平板、水琼脂平板和30 % PBA平板上，同1.3.1的方法做分生孢子萌发实验，25 ℃黑暗条件下培养，在24 h、48 h、72 h镜检，观察孢子萌发情况，计算萌发率。

1.4 数据统计

分生孢子萌发率=(萌发的孢子个数 / 检查的孢子总数)×100%[11]

2 结果与分析

2.1 不同分生孢子获取方法比较

从田间带有分生孢子角的发病组织可以直接获得分生孢子。或者病部带有分生孢子器的病组织置于保湿器内，经过几十分钟就可以获得大量分生孢子。但是，所获得的分生孢子在培养过程中易被其它杂菌污染，且分生孢子大小存在差异。

经梨树枝条接种腐烂病菌后3 d显症，14 d后在枝条上形成大量的黑色分生孢子器，部分吐出黄色卷曲的分生孢子角。在30 % PBA培养基上接种病菌菌饼12 d后表面产生凸起的分生孢子器，这两种方法所获得分生孢子大小基本一致，在一定时间内萌发率均在90%以上。在PDA平板上接种梨树腐烂病菌菌饼后，3～5 d菌落长满全皿，7 d后开始凸起少量白色的产孢体，但直到50 d仍未获得成熟可萌发的分生孢子(见表1)。

表1 分生孢子不同获取方法比较结果

注：“-”表示白色菌丝大量生长，无法准确计数。

2.2 分生孢子萌发条件的测定结果

2.2.1 温度对分生孢子萌发的影响

病菌分生孢子在相同的湿度、pH、营养条件，黑暗下培养观察(见表2)可知，分生孢子在15～35 ℃范围内经一段时间培养后均能萌发。15 ℃时经36 h后培养萌发率可达16. 3 %，当温度达到25 ℃时仅需12 h萌发率就可达11. 3 %，但当温度超过35 ℃时萌发所需时间较长，温度超过40 ℃时会出现分生孢子萌发前的变形现象。在25 ℃和30 ℃培养相同时间后，25 ℃萌发率高于同期30 ℃萌发率。因此确定25 ℃有利于分生孢子的萌发。

表2 温度对分生孢子萌发的影响

注：“-”表示白色菌丝大量生长，无法准确计数。

2.2.2 湿度对分生孢子萌发的影响

在pH、营养一致，25 ℃黑暗恒温培养后，由表3可得，分生孢子在相对湿度100%条件下24 h已有萌发，在相对湿度95%的条件下36 h后开始萌发，在48 h时相对湿度为90%的条件下分生孢子有萌发前的变形现象，在观察期内相对湿度低于90%时无孢子萌发，也无萌发前的变形现象。

表3 湿度对分生孢子萌发的影响

注：“-”表示白色菌丝大量生长，无法准确计数。

2.2.3 pH对分生孢子萌发的影响

控制湿度、营养一致，25 ℃黑暗条件下培养观察，由表4可知，病菌分生孢子在酸碱度范围为3. 0～7. 0均能萌发，pH低于2. 0和或者高于8. 0分生孢子不能萌发。分生孢子在pH为3. 0和7. 0条件下，48 h后有少量孢子萌发；pH为5. 0和6. 0时，分生孢子在12 h时萌发率可达15. 7%以上。由此可见该菌分生孢子在酸性条件下易萌发。PH为5. 0时分生孢子萌发率最高，因此确定该菌分生孢子的最适萌发酸碱度为pH=5. 0。

表4 pH对分生孢子萌发的影响

注：“-”表示白色菌丝大量生长，无法准确计数。

2.2.4 光照条件对分生孢子萌发的影响

病菌分生孢子在湿度、pH、营养一致的条件下，由表5可知，不同光照条件对梨树腐烂病菌分生孢子的萌发有一定的影响。且在全黑暗条件下分生孢子萌发率最高，在全光照条件下分生孢子萌发率最低。因此，全黑暗条件利于分生孢子萌发。

表5 光照条件对分生孢子萌发的影响

注：利用新复极差法，同一列进行多重比较，不同字母表示0. 05水平上差异显著。

2.2.5 营养条件对分生孢子萌发的影响

由表6可知，病菌分生孢子在不同培养基上萌发率不同，在PDA培养基上萌发率最高，30 % PBA培养基次之，在水琼脂培养基上萌发率最低，说明该菌分生孢子萌发需要一定的营养条件。

表6 营养条件对分生孢子萌发的影响

注：“-”表示白色菌丝大量生长，无法准确计数

3 结论

采集田间发病组织、梨树枝条和30 % PBA培养基接种培养等方法均能获得分生孢子，在PDA培养基上形成产孢体，观察期内未获得分生孢子。田间发病组织采集容易、获得分生孢子所需时间较短，但易被杂菌污染。经梨树枝条和30 % PBA培养基接种培养，在15 d均可获得形态较为一致，萌发率较好的分生孢子。香梨腐烂病菌分生孢子萌发的最适条件为温度25 ℃、pH 5. 0、相对湿度100 %、黑暗条件和一定的营养条件。

4 讨论

梨树腐烂病菌可存活4年左右，一个病斑释放孢子的能力可持续1年半，其分生孢子常与胶质物一起形成孢子角，在雨后或高湿的条件下，分生孢子器及子囊壳便可释放分生孢子，通过分生孢子传播扩散进行侵染循环。在梨树腐烂病的研究过程中需要大量且整齐度均一的分生孢子作为进行病原鉴定、病害流行规律、防治技术等方面的实验原材料。因此，本实验采用前期研究所筛选到的产孢基质，可以诱导病原菌快速、大量的产生子实体，获得了生理状况基本一致的分生孢子，所以在分生孢子萌发实验中保证了供试分生孢子的一致性。

在苹果树腐烂病菌分生孢子获取方法与萌发条件的研究中,本研究将周宗山[12]分生孢子获取方法做了优化调整，与其的结果不同之处是接种PDA培养基上的苹果树腐烂病菌在40～45 d可获得分生孢子角，而本研究中分生孢子器在50 d时未观察到此现象，而在枝条或树皮培养基上产孢都较为理想，这可能是由于营养环境的改变，加速了病菌由营养生长向生殖生长的过渡时间。在臧睿[13]等人的苹果树腐烂病菌分生孢子的萌发条件的研究中，各种光照处理对其分生孢子萌发无明显影响，本实验中黑暗条件有利于分生孢子的萌发，其他与梨树腐烂病分生孢子萌发条件基本一致。

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Study on Acquisition Method and Germination Condition of Conidiospore of Pear Tree Canker Pathogen

Tang Junyu1Wang Yanfang1Li Chunyan1Gou Qiao1Xie Xin1Zhang Wangbing1，2*

(1 College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

(2 Comprehensive management of Agricultural Pests in South Xinjiang Key Laboratory, Xinjiang 843300)

[Objective]Conidia plays an important role in the spread of tree canker pathogens ,and it is an major experimental material in studying rot fungi. Therefore, It is significant to gain condia with almost the same morphology and germination rate.[Methods]Pathogen conidia obtained with different methods, was placed in distinct circumstances to measure germination rate in order to select optimal acquisition method and germination conditions.[Results]It is easier to obtain conidia with which the incidence tissues directly collected from field, but it is easier polluted; Condia with consistent germination rate and morphology can be attained both in case of inoculated in disease branches and 30 % PBA culture for about 15 d.[Conclusion]The conidia germination optimum temperature is 25 ℃, relative humidity 100 %, and pH 5.0-6.0, under the dark condition and certain nutrients.

fragrant pear in korla; canker pathogen; condia; germination

2014-06-18

国家级大学生创新创业训练计划(201310757002)；塔里木大学校长基金项目(TDZKSS201401)。

唐俊煜(1989-)，男，2014级在读硕士，研究方向为果树优质高效栽培生理。E-mail：704203773@qq.com.

*为通讯作者E-mail：zwbzky@163.com

1009-0568(2014)01-0029-06

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.01.003