鱼藤素对肝癌细胞株SMMC-7721增殖抑制和凋亡诱导作用的研究

李争光，吴 骏，吴昌平，蒋敬庭，鲁 露，徐 斌，郑 晓

(苏州大学附属第三医院肿瘤中心，江苏 常州 213003)

原发性肝癌在全球范围内发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第3位，严重威胁着人类的生命健康［1］。我国为肝癌高发区，每年肝癌死亡病例约占全球的50%。肝癌起病隐匿，许多患者就诊时已是晚期，其生存期一般只有3～6个月。经过近几十年的努力，肝癌的诊疗虽然取得了巨大的进步，但其总体疗效仍不令人满意，5 a生存率低于12%。鱼藤素是一种天然的鱼藤酮类化合物，在多种肿瘤细胞和动物模型中均证实具有较强的抗肿瘤及化疗増敏作用，鱼藤素在肝癌中的作用尚未见报道［2-5］。本研究观测鱼藤素对肝癌细胞株SMMC-7721的作用，并初步探索其作用机制，为鱼藤素的进一步研究开发和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 鱼藤素、二甲亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、噻唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司，氟尿嘧啶购自天津金耀有限公司，RPMI-1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司，蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，抗总Akt(t-Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、GAPDH一抗购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。实验中所用其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721为本实验室保藏并常规传代培养，生长于含有体积分数10%灭活胎牛血清，青霉素(100 U·mL-1)和链霉素(100 g·L-1)的RPMI-1640培养基中，于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。细胞常规3～4 d传代1次，所有实验采用对数生长期细胞。所用鱼藤素首先溶于DMSO作为储备液，然后稀释于RPMI-1640培养基中作为工作液，保证工作液DMSO质量分数小于0.1%。

1.2.2 MTT法测定细胞活力 取对数生长期细胞，常规胰酶消化成单个细胞悬液，每孔3～5×103细胞接种于96孔板，于培养箱内孵育过夜后，每孔加入含不同浓度鱼藤素(0～100 μmol·L-1)的RPMI-1640继续孵育24～72 h，孵育48 h之后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，继续孵育4 h。弃去上清后，每孔加入150 μL DMSO，室温振荡摇匀，用酶标仪于570 nm波长测定吸光度值。按照下列公式计算药物对细胞的抑制率:抑制率(%)=［(对照组OD-实验组OD)/对照组OD］×100%。

1.2.3 细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳 采用1 μmol·L-1鱼藤素处理细胞48 h后收集5×106个细胞，PBS洗涤细胞3次，重悬于适量裂解液5 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、体积分数0.25%Nonidet P-40和1 mmol·L-1EDTA，加入无 DNA酶的 RNA酶 0.2 g·L-1，37℃水浴孵育1 h，再加入蛋白酶 K 0.3 g·L-1，37 ℃水浴孵育1 h，取20 μL 上清在质量分数1.5% 琼脂糖凝胶，50 V电压下电泳2 h后观察DNA ladder的形成。

1.2.4 细胞形态学观测 取对数生长期细胞，常规胰酶消化成单个细胞悬液，每孔1×104个细胞，接种于6孔板，于培养箱内孵育过夜。细胞贴壁后，如上以1 μmol·L-1鱼藤素处理72 h，体积分数70%冷乙醇固定细胞后，以0.001 g·L-1的PI染色倒置荧光显微镜下观察，同时未处理细胞为对照。

1.2.5 Western blot检测蛋白水平 细胞如上以1 μmol·L-1鱼藤素处理72 h后，收集1×107个细胞，按说明书以蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，用蛋白定量试剂盒定量，与5×样品缓冲液混合，煮沸5 min。将样品每泳道20 μg在质量分数12%SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳，然后将蛋白转印至PVDF膜。用封闭缓冲液(质量分数5%脱脂奶粉，20 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1NaCl，体积分数 0.1%Tween-20，pH 7.6)封闭1 h后，加入所需一抗4℃孵育过夜。TBS/T洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育30 min，ECL法显色并曝光。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计学分析，以¯x±s表示计量数据，2组之间比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 鱼藤素抑制SMMC-7721细胞增殖 MTT实验结果显示(图1)，鱼藤素处理后可明显抑制SMMC-7721细胞增殖，随着鱼藤素浓度的增加，其抑制作用随之增强，提示其作用呈剂量依赖性。各剂量组与对照组相比，相对细胞增殖抑制率比较差异均有统计学意义(P均＜0.05)。随鱼藤素处理时间延长，其抑制作用随之增强，以0.8 μmol·L-1鱼藤素处理 24 、48、72 h，其抑制率分别为(21.4±6.5)%、(35.5±3.9)%、(41.9±2.2)%，可见其作用呈时间依赖性。

图1 细胞活力分析结果

2.2 鱼藤素诱导 SMMC-7721细胞凋亡2 μmol·L-1鱼藤素处理48 h后收集细胞，行DNA琼脂糖凝胶电泳，结果处理后由大约180～200 bp的DNA片段形成典型的DNA ladder，说明鱼藤素诱导了SMMC-7721细胞凋亡(图2)。形态学观测所见进一步证实，与处理细胞相比，SMMC-7721细胞经1 μmol·L-1鱼藤素处理72 h后，细胞总数、增殖分裂细胞减少，凋亡细胞增多(图3)。

2.3 鱼藤素对Akt的影响 Western blot检测结果示鱼藤素处理前后t-Akt水平无明显变化，但SMMC-7721细胞经1 μmol·L-1鱼藤素处理72 h后p-Akt水平较处理前明显降低(图4)。提示鱼藤素不影响Akt的水平，但明显抑制其磷酸化水平，从而抑制其活性。

3 讨论

肝癌与其他大多数恶性肿瘤一样，其发生发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞凋亡有关，故寻找有效抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的药物，一直肿瘤治疗研究的热点［6-8］。

鱼藤素是一种天然鱼藤酮类化合物，最初被用作杀虫剂，但进一步的研究发现鱼藤素对恶性肿瘤有较强的预防和治疗作用。本研究选用SMMC-7721细胞作为实验细胞，在体外观察了鱼藤素的抗肿瘤作用，结果证实鱼藤素可抑制肝癌细胞的增殖，其作用呈时间和剂量依赖性。细胞形态学的改变、DNA琼脂糖凝胶电泳梯形条带的出现均表明鱼藤素能诱导SMMC-7721细胞凋亡。鱼藤素抗肿瘤的主要作用是通过下调Akt的磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信号转导通路实现的［4］，本文结果再次证实了这一机制。PI3K/Akt信号通路在肿瘤细胞的生长、增殖、死亡、存活过程中发挥着重要作用，是潜在抗肿瘤治疗靶点［9-11］。Akt活化后可以通过磷酸化作用调控下游靶蛋白 Bad、Caspase-9、NF-B、mTOR等，经多种途径促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子［12］。鱼藤素正是通过下调Akt的磷酸化水平抑制其活性，从而发挥作用的。

图4 Western blot蛋白水平检测结果

总之，鱼藤素对SMMC-7721细胞有增殖抑制和凋亡诱导作用，其作用机制与Akt磷酸化水平下调，活性抑制有关，但其深入作用机制还有待进一步研究。

［1］El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis［J］.Gastroenterology，2007 ，132(7):2557-2576.

［2］Bortul R，Tazzari PL，Billi AM，et al.Deguelin，A PI3K/AKT inhibitor，enhances chemosensitivity of leukaemia cells with an active PI3K/AKT pathway ［J］.Br J Haematol，2005，129(5):677-686.

［3］Chen Y，Wu Q，Cui GH，et al.Deguelin blocks cells survival signal pathways and induces apoptosis of HL-60 cells in vitro［J］.Int J Hematol，2009 ，89(5):618-623.

［4］Chun KH，Kosmeder JW，Sun S，et al.Effects of deguelin on the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and apoptosis in premalignant human bronchial epithelial cells ［J］.J Natl Cancer Inst，2003，95(4):291-302.

［5］Hecht SS.Deguelin as a chemopreventive agent in mouse lung tumorigenesis induced by tobacco smoke carcinogens［J］.J Natl Cancer Inst，2005 ，97(22):1634-1635.

［6］Pathak AK，Bhutani M，Nair AS，et al.Ursolic acid inhibits STAT3 activation pathway leading to suppression of proliferation and chemosensitization of human multiple myeloma cells［J］.Mol Cancer Res，2007，5(9):943-955.

［7］Schapher M，Wendler O，Gröschl M.Salivary cytokines in cell proliferation and cancer［J］.Clin Chim Acta，2011，412(19-20):1740-1748.

［8］Wong RS.Apoptosis in cancer:from pathogenesis to treatment［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30:87.

［9］Fresno Vara JA，Casado E，de Castro J，et al.PI3K/Akt signalling pathway and cancer［J］.Cancer Treat Rev，2004，30(2):193-204.

［10］Lu Y，Wang H，Mills GB.Targeting PI3K-AKT pathway for cancer therapy［J］.Rev Clin Exp Hematol，2003 ，7(2):205-228.

［11］Mitsiades CS，Mitsiades N，Koutsilieris M.The Akt pathway:molecular targets for anti-cancer drug development［J］.Curr Cancer Drug Targets，2004，4(3):235-256.

［12］Song G，Ouyang G，Bao S.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival［J］.J Cell Mol Med，2005，9(1):59-71.