丹参酮ⅡA对自发性高血压大鼠血清前胶原末端肽的影响

李醇文 周亚光 陈 娣 梁黔生 杨光田

(华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科,湖北 武汉 430030)

心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是高血压引起心脏病变的主要病理特征之一,其发病机制尚不十分清楚,研究预防和控制高血压引起的 MF具有十分重要的临床意义。丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TSN)作为我国传统中药丹参中最重要的血管活性成分,已广泛应用于心血管疾病的治疗,但是其作用机制不是十分清楚。本实验主要通过观察血清I型前胶原氨基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前胶原羧基端肽(PⅢ NP)水平的变化,探讨TSN对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHRS)MF的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SHR 24只,雄性,8周龄,北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔合格证号 SCXK(京)2002-2003〕;Wistar大鼠,8只,雄性,8周龄,华中科技大学同济医学院实验动物中心提供〔合格证号:SYSY(鄂)2004-0028〕。SHR随机分为三组:SHR对照组,丹参酮组,缬沙坦组;每组 8只。8只 Wistar大鼠为正常对照组。正常对照组及 SHR对照组:注射用水 1 ml/kg腹腔注射;丹参酮组:TSN 40 mg/kg腹腔注射;缬沙坦组:缬沙坦 20 mg/kg灌胃。每日分别给予相应的治疗1次,共 4 w。

1.2 试剂与仪器 丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(TSN,诺新康,上海第一生化药业有限公司,国药准字 H31022558),缬沙坦(代文,北京诺华制药有限公司,国药准字 H20040217),PⅠCP和 PⅢNP放免试剂盒(Orion Diagnostica提供),大鼠尾动脉血压计和 RM6240BD型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂),电子天平等。

1.3 大鼠血压测定 采用尾动脉套袖法,在清醒、安静与恒温(28℃)状态下测量血压,每只大鼠连续测量 3次,取平均值。

1.4 心室质量和心室质量指数的检测 实验结束时大鼠称体重后处死,取出心脏,用 4℃磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,滤纸吸干水分后,沿房室交界剪去心房,称取剩余的心室质量,并计算心室质量指数(心室质量/体重)。然后将上述心肌组织部分用于胶原纤维(VG)染色,部分置于-70℃冰箱冻存保存用于mRNA表达的检测。

1.5 心肌VG染色及胶原容积分数测定 取左室中段横截面心肌组织,常规固定、包埋和制片,进行 VG染色。然后连接图像分析系统,每张切片随机选取 10个高倍视野(500倍),通过测量选定区域染色组织的面积(红色代表胶原纤维),计算胶原面积与心肌组织总面积的比值,作为每个视野中胶原组织占的百分比,取其均值,即为胶原容积分数(CVF)。

1.6 血清 PⅠCP和PⅢNP浓度测定 从颈动脉取血 3 ml,标本分离血清置于-20℃冰箱保存待测。按照放免分析试剂盒说明书提供的方法对血清PⅠCP和 PⅢ NP浓度进行检测。

1.7 统计学分析 应用SPSS12.0统计软件处理,数据以±s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验。

2 结 果

2.1 TSN对血压的影响 与正常对照组比较,SHR对照组的血压随着周龄的增长而明显升高(P＜0.01),而经 TSN和缬沙坦治疗 4 w后,两组血压较 SHR对照组明显下降(P＜0.01)。见图 1。

2.2 TSN对心室质量和心室质量指数的影响 12 w时,SHR对照组心室质量和心室质量指数均显著高于其他组(P＜0.01);而与SHR对照组相比,丹参酮组和缬沙坦组心室质量和心室质量指数均有所下降(P＜0.05)。见表 1。

2.3 TSN对心肌胶原的影响 VG染色法清晰显示心肌胶原被染呈红色,分布于心肌内,主要聚集在血管周围。正常对照组心肌细胞之间、血管周围有少量胶原纤维。SHR对照组心肌间质和血管周围胶原纤维明显增多,且排列紊乱。丹参酮组和缬沙坦组大鼠心肌间质和血管周围胶原积聚明显减轻,排列也趋向规则。根据 CVF判断 MF程度,与正常对照组比较,SHR对照组存在着明显的 MF(P＜0.01);丹参酮组和 Val组MF较 SHR对照组明显减轻(P＜0.01)。见图 2,图 3。

图1 8w和 12 w时大鼠血压的比较

表1 各组心室质量和心室质量指数的比较(±s)

表1 各组心室质量和心室质量指数的比较(±s)

与 SHR对照组比较:1)P＜0.01,2)P＜0.05

组别 n 心室质量(g) 心室质量指数(g/kg)正常对照组 8 0.684±0.0361) 3.33±0.151)SHR对照组 8 0.774±0.048 3.85±0.46丹参酮组 8 0.702±0.0522) 3.58±0.362)缬沙坦组 8 0.691±0.0442) 3.42±0.232)

图2 心肌VG染色结果(×200)

2.4 TSN对血清 PⅠCP和 PⅢ NP浓度的影响 SHR对照组的血清 PⅠCP和 PⅢ NP均高于正常对照组(P＜0.05),丹参酮和缬沙坦组的血清 PⅠCP和 PⅢ NP较SHR对照组均有不同程度的降低(P＜0.05)。见表 2。组别 n PⅠCP PⅢ NP

图3 各组心肌胶原容积分数(CVF)

表2 各组血清 PⅠCP和 PⅢNP浓度的比较(μg/L,±s)

表2 各组血清 PⅠCP和 PⅢNP浓度的比较(μg/L,±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05;与 SHR对照组比较:2)P＜0.05

正常对照组 8 71.43±10.37 8.89±3.36 SHR对照组 8 102.87±13.261) 12.31±5.171)丹参酮组 8 87.21±12.192) 10.46±4.292)Val组 8 84.87±11.232) 10.18±4.572)

3 讨 论

心肌中胶原的合成与降解处于动态平衡,以保持胶原含量的稳定,一旦二者之间的平衡被打破,胶原产生增多或降解下降,均可使胶原过多沉积,导致 MF。MF是指心肌组织中VG异常沉积,导致其胶原浓度或 CVF显著升高;是高血压引起心脏病变的重要原因〔1〕。血清PⅠCP和 PⅢ NP是胶原合成过程中形成的小分子多肽。在胶原合成过程中,血清前胶原末端肽被释放入血,以游离片段形式出现于循环中。由于血清前胶原末端肽的释放与 VG的生成是 1∶1的关系,所以胶原合成增强的同时伴随着血清前胶原末端肽的生成、释放增加。因此,可以通过检测血清前胶原末端肽的水平来评估心肌胶原合成代谢的程度〔2〕。研究发现,高血压病患者血清 PⅠCP和 PⅢNP浓度明显升高且与 MF密切相关〔3〕。

TSN是我国传统中药丹参中最重要的血管活性成分,本课题组前期研究已经证实其能够抑制大鼠的心肌肥厚〔4,5〕。唐忠志等人的研究表明丹参能够预防和逆转SHR的MF,其机制可能与抑制心脏局部醛固酮生成、调节氧自由基代谢等有关〔6〕。邹昌群等人通过体外细胞培养证实 TSN能够抑制大鼠心脏成纤维细胞增殖及表型转化,减少细胞外基质生成,延缓 MF进展〔7〕。而本实验用 SHR来模拟原发性高血压,研究发现,与正常血压对照组相比,SHR对照组血压、心室质量、心室质量指数和 CVF均明显升高,说明SHR血压升高的同时伴随有 MF;而丹参酮组血压、心室质量、心室质量指数和 CVF均有不同程度的降低,说明TSN不仅可以降低血压亦可以抑制MF,对心肌具有保护作用。进一步分析发现 SHR对照组血清 PⅠCP和 PⅢNP浓度明显升高,而丹参酮组则有所降低,说明血清PⅠCP和PⅢNP与 MF密切相关。由于血清 PⅠCP和 PⅢ NP浓度是反映心肌胶原合成水平的指标〔8〕;因此,推测 TSN抑制 MF的机制是通过抑制心肌胶原的合成来实现的。然而,MF的调控因素非常复杂,TSN具体通过何种途径抑制心肌胶原的合成,还需要进一步的实验研究。

1 Berk BC,Fujiwara K,Lehoux S.ECM remodeling in hypertensive heart disease〔J〕.J Clin Invest,2007;117(3):568-75.

2 杨 锐,陶贵树.高血压心肌纤维化的研究进展〔J〕.心血管病学进展,2005;26(5):478-80.

3 Diez J.Laviades C,Myaor G,et al.Increased serum concentrations of procollagen peptides in essential hypertension.Relation to cardiac alterations〔J〕.Circulation,1995;91(5):1450-6.

4 Li Y,Yang Y,Yu D,et al.Theeffect of tanshinone IIA upon the TGF-beta1/Smadssignaling pathway in hypertrophic myocardium of hypertensive rats〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2009;29(4):476-80.

5 Tu EY,Zhou YG,Wang ZH,et al.Effects of tanshinone IIA on the myocardial hypertrophy signal transduction system protein kinase B in rats〔J〕.Chin JIntegr Med,2009;15(5):365-70.

6 唐忠志,郑 智,唐 瑛,等.丹参对自发性高血压大鼠心肌纤维化的逆转作用及其机制研究〔J〕.华中科技大学学报:医学版,2002;31(3),292-4.

7 邹昌群,占成业,白祥军.丹参酮ⅡA抗心肌纤维化作用机制实验研究〔J〕.内科急危重症杂志,2008;14(5):242-5.

8 Diez J,Panizo A,Gil MJ,et al.Serum markers collagen type I metabolism in spontaneously hypertensive rats:relation to myocardial fibrosis〔J〕.Circulation,1996;93(3):1026-32.