HPLC法测定益心通脉颗粒中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量

王艳伟，代雪平，王晓伟

(河南省食品药品检验所，郑州 450018)

益心通脉颗粒处方由黄芪、人参、北沙参、玄参、丹参、川芎、郁金和炙甘草8味药组成，具有益气养阴、活血通络的功效，主治气阴两虚、瘀血阻络所致的胸痹，症见胸闷心痛、心悸气短、倦怠汗出和咽喉干燥及冠心病心绞痛见上述证候者[1]。丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦和凉血消痈的功效，广泛应用于心血管疾病的治疗，为方中主药。该制剂质量标准收载于《中国药典》2015年版一部，采用HPLC法测定丹参酮ⅡA的含量。在实际检验工作中，我们发现该含量测定方法，不能准确测出丹参酮ⅡA的含量。因丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA是丹参中活性较强、含量较高的有效成分[2-9]，为了提高标准的可操作性，对该标准进行了完善和提高，研究建立了同时测定益心通脉颗粒中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量测定方法，为全面控制益心通脉颗粒的质量提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260 DAD检测器(美国安捷伦科技有限公司)；KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XPE205电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；XMTD-204数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)。

1.2试药 丹参酮Ⅰ对照品(批号110867-201607)、隐丹参酮对照品(批号110852-200806)和丹参酮ⅡA对照品(批号110766-201520)，均购自中国食品药品检定研究院；益心通脉颗粒(河南辅仁堂制药有限公司提供，批号：20161201，20170102，20170305，20170601，20170602)；甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Luna 5 μm C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(67∶33)；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃。理论塔板数按照丹参酮ⅡA峰计算应不低于5 000[10-13]。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 取丹参酮Ⅰ对照品、隐丹参酮对照品和丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置于同一棕色量瓶中，加甲醇制成丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA质量浓度分别为 42.0，35.8和31.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取本品，研细，精密称取5 g，置于棕色具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[14-15]。

2.2.3阴性样品溶液 按照益心通脉颗粒处方比例和工艺制备缺丹参的阴性样品，按照2.2.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.3专属性实验 按照2.1项下色谱条件，取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，进样测定。供试品色谱中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA与其相邻色谱峰均能达到良好的分离，阴性样品无干扰。见图1。

2.4线性关系考察 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液1，2，5，8，10，15，20和30 μL，按照2.1项下色谱条件测定。以峰面积y对进样量x进行线性回归，得丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的线性回归方程分别为：y=2 562.4x+7.530 7，r=1.000；y=4 566x-9.765 2，r=1.000；y=5 281.9x-10.746，r=1.000。结果表明，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA进样量分别在0.042～1.260，0.036～1.073和0.032～0.948 μg范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的峰面积，结果丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为0.2%，0.2%和0.2%，表明仪器精密度良好。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.丹参酮Ⅰ；2.隐丹参酮；3.丹参酮ⅡA。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.samples；C.negative control samples；1.tanshinone Ⅰ；2.cryptotanshinone；3.tanshinone ⅡA.

2.6稳定性实验 取益心通脉颗粒(批号20161201)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10和12 h进样分析。结果丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA峰面积的RSD值分别为1.1%，0.2%和0.2%，表明供试品溶液在室温放置12 h内稳定。

2.7重复性实验 取益心通脉颗粒(批号20161201)6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液。按照2.1项下色谱条件进样测定，计算其中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量。结果丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的平均含量分别为0.099 4，0.139 5和0.142 4 mg·g-1，其RSD值分别为0.5%，0.7%和0.6%。

2.8回收率实验 精密称取已知含量的益心通脉颗粒(批号20161201，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA含量分别为0.099 4，0.139 5和0.142 4 mg·g-1)6份，每份2.5 g，精密加入混合对照品溶液(丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA质量浓度分别为16.87，22.32和 20.22 μg·mL-1)25 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液。按照2.1项下色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA回收率实验结果

Tab.1 The results of recovery test of tanshinone Ⅰ,cryptotanshinone and tanshinone ⅡA

成分取样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%丹参酮Ⅰ2.500 20.248 50.421 80.657 897.0397.41.22.500 90.248 60.421 80.654 096.112.501 20.248 60.421 80.658 897.252.502 20.248 70.421 80.662 298.032.501 00.248 60.421 80.667 699.342.500 50.248 50.421 80.654 996.34隐丹参酮2.500 20.348 80.558 00.897 698.3699.51.62.500 90.348 90.558 00.900 998.932.501 20.348 90.558 00.905 799.782.502 20.349 10.558 00.910 0100.532.501 00.348 90.558 00.904 1102.042.500 50.348 80.558 00.918 297.65丹参酮ⅡA2.500 20.356 00.505 50.844 296.5797.60.82.500 90.356 10.505 50.851 297.942.501 20.356 20.505 50.848 297.342.502 20.356 30.505 50.849 597.562.501 00.356 10.505 50.846 797.052.500 50.356 10.505 50.855 798.84

2.9样品含量测定 按照2.2.2项下的供试品溶液制备方法和2.1项下色谱条件，测定5批益心通脉颗粒中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，结果见表2。

表2样品中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA含量测定结果

Tab.2 Determination results of tanshinone Ⅰ，cryptotanshinone and tanshinone ⅡA in samples(mg·g-1)

生产批号丹参酮Ⅰ含量隐丹参酮含量丹参酮ⅡA含量201612010.099 40.139 50.142 4201701020.210 20.241 30.333 4201703050.183 00.185 80.271 5201706010.174 40.260 70.362 4201706020.135 10.196 70.279 9

3 讨论

3.1提取方法的选择 以甲醇为提取溶剂，分别超声、加热回流1 h制备供试品溶液，测定样品中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，结果回流提取的含量较高，故选择回流提取[16-17]。

3.2提取溶剂的选择 分别以体积分数为50%的甲醇、体积分数为70%的甲醇、甲醇和二氯甲烷-甲醇(1∶1)为提取溶剂，加热回流1 h制备供试品溶液，测定样品中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，结果使用甲醇提取含量最高，故选择甲醇提取[18-20]。

3.3提取时间的选择 以甲醇为提取溶剂，分别加热回流30，60和90 min制备供试品溶液，测定样品中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，结果回流提取60 min后含量不再增加，故选择回流提取60 min。

4 结论

《中国药典》2015年版一部益心通脉颗粒含量测定项下采用二氯甲烷-甲醇(1∶1)混合溶液作为提取溶剂，实验研究表明，采用甲醇作为提取溶剂与采用二氯甲烷-甲醇(1∶1)混合溶液作为提取溶剂测得样品中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量差异较大，采用甲醇为提取溶剂能更准确地测定3种成分的含量。样品的含量测定结果表明，不同批次的产品3种成分含量差异较大，反映厂家需要关注不同批次产品之间的稳定性。新建立的含量测定方法优化了供试品溶液的制备方法，同时测定丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA等多个有效成分，有利于控制益心通脉颗粒的稳定性，保证药品的有效性。