提高化生平合剂二次开发的质量标准研究

赵文娜，白 静，周 凯，车晓侠，张爱军，王清晖，张抗怀

(西安交通大学第二附属医院，西安 710004)

化生平合剂是我院自主研发的治疗萎缩性胃炎癌前病变的非标准制剂，具有健脾益气、活血化瘀和清热解毒的功效，由黄芪、党参、丹参、虎杖、黄连、莪术、鸡内金、白花蛇舌草、三七和甘草等组成。本制剂已在临床应用20余年，疗效确切[1-2]。但原制备工艺和质量标准制定已不能满足现代制剂的要求，有必要对其进行二次开发，提高其质量控制水平。因此，本文对其处方中的丹参和虎杖应用TLC法进行了定性鉴别，并对其主要活性成分大黄素和丹参酮ⅡA应用HPLC法进行了定量测定，所建立的方法简便、准确、重复性好，可为该制剂的质量控制和评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，包括其工作站、自动进样器和1260-VWD紫外检测器(美国安捷伦科技公司)；METTLER-TOLEDO XS 105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Sartorius BT 25S型精密分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-300TDB高频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 大黄素对照品(批号110756-201512)，大黄素甲醚对照品(批号110758-201415)，丹参酮ⅡA对照品(批号110766-201520)，虎杖对照药材(批号120980-201005)，丹参对照药材(批号120923-201414)，均购自中国食品药品检定研究院；化生平合剂 (西安交通大学第二附属医院，批号：151027，160524和170418)；水为超纯水；甲醇(HPLC级)，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，成都科龙化工试剂厂；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1TLC定性鉴别

2.1.1虎杖 取本品溶液20 mL，加三氯甲烷30 mL，超声处理20 min，滤过。滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇使其溶解，作为供试品溶液。按照化生平合剂的制备工艺制备不含虎杖的阴性溶液，并按照供试品溶液的制备方法进行处理，作为阴性对照溶液。另取虎杖对照药材0.5 g，加三氯甲烷20 mL，同法制成对照药材溶液。取大黄素和大黄素甲醚对照品，加甲醇制成质量浓度均为1 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)实验，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，分别置于日光及紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性溶液在相应位置上未见明显斑点，阴性溶液无干扰，可有效鉴别虎杖。见图1A。

图1TLC图

A.虎杖：1.大黄素、大黄素甲醚对照品；2.虎杖对照药材；3～5.虎杖供试品溶液；6.阴性对照溶液。B.丹参：1.丹参酮ⅡA对照品；2.丹参对照药材；3～5.丹参供试品溶液；6.阴性对照溶液。

Fig.1 TLC chromatograms

A.Polygonumcuspidatum： 1.emodin and emodin ether reference solution；2.Polygonumcuspidatumcontrol solution ofPolygonumcuspidatum；3-5.sample solution ofPolygonumcuspidatum；6.negative control solution.B.Salviamiltiorrhiza：1.tanshinone ⅡA reference solution；2.Salviamiltiorrhizacontrol solution；3-5.sample solution ofSalviamiltiorrhiza；6.negative control solution.

2.1.2丹参 取本品20 mL，加乙醚30 mL，振摇，放置1 h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。按照化生平合剂的制备工艺制备不含丹参的阴性溶液，并按照上述供试品溶液的制备方法处理，作为阴性对照溶液。另取丹参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成质量浓度为2 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。按照TLC法(《中国药典》2015年版四部通则0502)实验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯(35∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗红色斑点。阴性溶液在相应位置上未见明显斑点，阴性溶液无干扰，可有效鉴别丹参。见图1B。

2.2含量测定

2.2.1溶液的制备 混合对照品溶液：精密称取大黄素和丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为78.2和10.8 μg·mL-1的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱中冷藏，备用。

供试品溶液：精密量取化生平合剂25 mL，水浴蒸干，残渣加适量甲醇溶解，过滤，滤液蒸干，用甲醇定容至1 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，进行HPLC分析前用 0.22 μm微孔滤膜过滤样品，即得。

阴性对照溶液：取化生平处方中除虎杖和丹参外的其余药材，按照制剂工艺制成阴性样品，按照上述供试品溶液制备方法制备得阴性对照溶液。

2.2.2色谱条件 采用Kromosil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-水(75∶25)为流动相；流速为1.0 mL·min-1；柱温为25 ℃；紫外检测波长为270 nm。

2.2.3系统适用性实验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照2.2.2项下色谱条件进样10 μL，见图2，药品中其他色谱峰对大黄素和丹参酮ⅡA色谱峰无干扰，且目标色谱峰能达到基线分离，峰形尖锐，基线平稳。

图2HPLC图

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；1.大黄素；2.丹参酮ⅡA。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference solution；B.sample solution；C.negative control solution；1.emodin；2.tanshinone ⅡA.

2.2.4线性关系考察 精密吸取对照品溶液2，6，10，14，18和20 μL，按照2.2.2项下色谱条件进样分析，以进样量为横坐标(x)、峰面积积分值为纵坐标(y)绘制标准曲线，其回归方程分别为：y=3 329.7x+10.992 4，r=0.999 8；y=5 831.8x+3.212 3，r=0.999 9，结果表明大黄素和丹参酮ⅡA在0.156 4～1.564和0.021 6～0.216 μg范围内均有良好的线性关系。

2.2.5精密度实验 精密吸取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，重复进样6次，进样量为10 μL，分别记录大黄素和丹参酮ⅡA的峰面积，计算RSD值分别为1.35%和1.66%，结果表明，该仪器精密度良好。

2.2.6稳定性考察 取同一供试品溶液(批号170418)，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别于制备后 0，1，2，4，6和24 h按照2.2.2项下色谱条件进样测定，计算得RSD值为1.83%，结果表明，该样品在24 h内基本稳定。

2.2.7重复性考察 取同一批次化生平样品(批号170418)，按照2.2.1项下方法平行制备6份供试品溶液，测定大黄素和丹参酮ⅡA的峰面积并分别记录，计算得RSD值分别为1.85%和1.96%。

2.2.8加样回收率实验 精密量取已知含量的化生平样品15 mL(批号170418)5份，分别精密加入质量浓度为80.5和4.8 μg·mL-1的大黄素和丹参酮ⅡA混合对照品溶液1.0 mL，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2.2项下色谱条件进样测定，分别计算回收率。结果大黄素的平均回收率为98.42%，RSD值为1.11%，丹参酮ⅡA的平均回收率为103.29%，RSD值为1.54%。见表1。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery experiment(n=5)

成分样品中量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%大黄素97.3580.50175.4898.6798.421.1197.3580.50173.5397.5797.3580.50176.2999.1297.3580.50172.5397.0197.3580.50177.3599.72丹参酮ⅡA3.604.808.83105.12103.291.543.604.808.49101.073.604.808.62102.623.604.808.69103.453.604.808.75104.17

2.2.9样品含量测定 精密量取不同批号(151027，160524和170418)的样品25 mL，按照2.2.1项下方法制备供试品溶液，用微孔滤膜过滤后按照2.2.2项下色谱条件进样分析。把大黄素和丹参酮ⅡA的峰面积积分值带入标准曲线方程计算不同批次药品中的含量。结果3批化生平样品中大黄素和丹参酮ⅡA的含量分别为6.05和0.19，6.36和0.21以及6.49和0.24 μg·mL-1。

3 讨论

胃癌是一种全球高发的消化系统恶性肿瘤，其病死率仅次于肺癌和肝癌，高居第3 位。中国每年胃癌新发病例数达40万例，占世界新发病例数的42%，病死率和发病率位于全球前20位，高于世界平均水平[3-4]。相关研究证实，胃癌的发生发展是一个多阶段、多因素、多基因变异累积的结果，存在着一系列的中间过程，即慢性非萎缩性胃炎→慢性萎缩性胃炎肠上皮化生→胃黏膜异形增生→早期胃癌→进展期胃癌这一模式[5-6]。目前，提高胃癌的生存率主要依靠预防，即有效防治胃癌癌前病变[7]。中医认为胃癌癌前病变可归属于胃脘痛、心下痞硬和痞满等范畴，而健脾益气、调气活血和清热化湿解毒是其治疗的根本方法[8-10]。化生平合剂处方以健脾益气、活血化瘀和清热解毒立法，其中黄芪和党参具有健脾益气的作用，王娜等[11]和车晓侠等[12]虽然建立了化生平中黄芪主要成分黄芪甲苷的含量测定方法，但样品前处理要经过萃取、过柱以及反复洗脱，步骤冗繁，耗时耗力，易造成误差，且检测波长在203 nm处其他物质吸收对黄芪甲苷吸收峰干扰较大。因此，在化生平合剂的二次开发中我们对处方中发挥活血化瘀、清热解毒作用的丹参和虎杖的指标性成分丹参酮ⅡA和大黄素进行了含量测定。

样品的处理：参照《中国药典》虎杖和丹参项下的样品处理方法[13]，取化生平合剂适量，用三氯甲烷和硫酸溶液提取，提取液蒸干后用甲醇溶解，过滤，进样后发现只有大黄素出峰，丹参酮ⅡA不出峰，将样品蒸干后直接用甲醇提取，2个目标峰均出现，且供试品中其他杂质峰对目标峰无干扰，操作简便。

流动相和检测波长的选择：参照《中国药典》及相关文献方法[13-19]，分别用乙腈-1 mL·L-1磷酸水(22∶78)、甲醇-1 mL·L-1磷酸水(80∶20)、甲醇-1 mL·L-1磷酸水(75∶25)和甲醇-水(75∶25)作为流动相进行考察，发现在甲醇-水(75∶25)流动相条件下，其他杂质峰对大黄素和丹参酮ⅡA均无干扰，重复性好、方法简便。在波长254 nm处进行HPLC分析，丹参酮ⅡA色谱峰面积比在270 nm条件下低，而大黄素吸收峰影响不大，因此选用270 nm作为检测波长。

综上所述，本研究所建立的测定方法操作简便，精密度、稳定性良好，可用于化生平合剂的质量控制。