产β-葡聚糖酶突变株培养基的优化

邵金华刘凯杨锦兀

（湖南科技学院 生命科学与化学工程系，湖南 永州 425100）

β-葡聚糖属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是以右旋葡萄糖为基本单位，属于多糖类中的同多糖类，具有线型的空间结构,存在于禾谷类（包括大麦、燕麦、黑麦和小麦等）的糊粉层和胚乳细胞壁中。谷物类β-葡聚糖独特的分子结构，赋予了其独特的性质，能以高分子量的形式溶于水，且形成溶液的粘度很高，给工业生产带来了诸多的不便。β－葡聚糖酶属于水解酶类，具有降解β-葡聚糖，破坏植物细胞壁结构；提高内源性消化酶活性，减少肠道微生物，降低小肠内容物粘度；利于动物对营养物质的消化和吸收,同时，提高生长性能和粮食的转化率，在食品、饲料工业等方面有广阔应用前景。

1.料和方法

1.1.种

突变株Bacillus subtilis spp.，由本实验室在校园内的土壤中筛选后诱变制得。

1.2.要原料和试剂

大麦粉，购自重庆漓泉啤酒厂，磨成粉，过80目筛。

标准大麦β－葡聚糖，美国Sigma公司产品。

其它试剂均为分析纯。

1.3.养基及培养条件

1.3.1.本培养基(g/l00ml):

蛋白胨 1.0，牛肉膏0.4，琼脂 1.8，NaCl0.4，pH 7.2; 121℃，25min灭菌。

1.3.2.始培养基（g/100mL）

大麦β-葡聚糖 0.2, KNO30.1, NaH2PO40.002, MgS040.03, CaCO30.005, FeCl30.002 , 刚果红0.004,琼脂1.8,pH 7.2，121℃，25 min灭菌。

1.3.3.瓶发酵条件

在250ml的三角瓶中装入35ml培养基，1210C,灭菌 25 min，冷却至室温，接种（接种量为2.2x106个孢子/ml 发酵液），pH值6.5，370C, 200r/min振荡培养60h。

1.4.验方法

1.4.1.－葡聚糖酶酶活力测定[1]待测粗酶液用pH6.0的乙酸钠缓冲液稀释一倍，取经60℃预热的此稀释酶液1.0ml，加入经60℃预热的1.0%β-葡聚糖溶液1.0ml，60℃恒温准确反应10min，立即加入DNS试剂3ml，混匀，立即用DNS法测定还原糖含量。酶活单位定义： 在上述反应条件下1s中从大麦β-葡聚糖产生1nmol葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位（u）。

1.4.2.酵液，还原糖含量测定:DNS法[2]

1.4.3.酵液总糖含量测定:盐酸水解法[3]

1.4.4.酵液pH测定:pH计法

1.4.5.酶的培养基优化

在初始培养基的基础上依次改变碳源和氮源的种类及浓度，再分别确定各微量元素的最佳添加量。

2.果和讨论

2.1.同碳源对产酶的影响

用六种常见碳源分别代替基础培养基中的碳源进行单因素试验，碳源添加量以总糖含量相等为依据。表2-1表明，大麦粉是最佳的碳源，可能是因为β-葡聚糖酶是一种典型诱导酶，特定的碳源对酶合成具有一定诱导效应[4]。

表2.1碳源对产酶的影响

2.2.同氮源对产酶的影响

本实验选择了常用的几种无机氮源和有机氮源进行氮源单因素实验(添加量以N元素摩尔数相等为依据)。结果表明，酵母粉为最好的氮源，其次为豆饼粉。

表2.2 氮源对产酶的影响

2.3.gSO4浓度对产酶的影响

对细胞来说，Mg2+是金属离子当中较为重要的一种，它是许多酶活性中心不可缺少的一部分，结果表明MgS04的最适浓度为0.02g/100ml,超过0.02g/100ml会抑制酶的活性。

图2.1 MgSO4浓度对β-葡聚糖酶产酶的影响

2.4.H2PO4的浓度对产酶的影响

在添加的营养盐中，对KH2PO4的浓度高低是否影响β-葡聚糖酶的酶活进行了对比实验，图2-2表明，高浓度的KH2PO4对β-葡聚糖酶的酶活有抑制作用，KH2PO4浓度最佳量为0.002（g/l00ml）。

2.5.aC03浓度对产酶的影响

钙一般不参与微生物的细胞结构物质，但它是某些酶的激活剂，而且钙离子能调节细胞透性，对β-葡聚糖酶也有一定的激活作用[5]。从图2-3可以看出，CaC03的最适浓度0.05g/100ml.

图2.3 CaCO3浓度对产酶的影响

2. 6正交试验确定最佳碳氮比及最佳培养基配方

本实验选择了大麦粉、玉米粉、豆粕粉,MgS04, CaC03浓度进行五因素四水平的正交试验[6]。由表2-3可知，大麦粉浓度是影响最显著的因素，五个因素对发酵产酶的显著性依次为A>C> B>D>E，最佳条件分别为A3B3C4D3E3，即最适浓度(g/l00ml)为大麦粉3.0，玉米粉2.0, 豆粕粉4.0，MgSO40.03, CaCO30.05。按此方案进行验证实验，产β-葡聚糖酶活力达到56.53U/ml，是初始产酶条件的1.8倍.

表2.3培养基配方正交试验结果分析表

3. 论

采用单因素实验和正交实验对芽孢杆菌突变株Bacillus subtilis spp.摇瓶分批发酵生产β-葡聚糖酶的培养基和发酵条件进行了研究，得出其最佳培养基配方为(g/100ml): 大麦粉3.0，玉米粉2.0, 豆粕粉4.0，MgSO40.03, CaCO30.05; 糊精、大麦粉等多糖有利于突变株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶的产生，葡萄糖、蔗糖等易利用性碳源不利于菌体生物量的积累和β-葡聚糖酶的产生。酵母粉为突变株Bacillus subtilis spp.产β-葡聚糖酶的最佳氮源，其次为豆饼粉;试验中选用的无机氮源均不利于β-葡聚糖酶的产生。MgS04和CaCO3浓度对β-葡聚糖酶的产生有较大影响，而KH2PO4浓度对β-葡聚糖酶的产生影响较小。突变株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶产生受大麦β-葡聚糖的诱导作用。

[1]赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2002.

[2]周德庆.微生物学实验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986.

[3]杨汝德，现代工业微生物学[M].广州:华南理工大学出版社,2001,157-158.

[4]万平平,丁爱云,李安娜,黄玉杰. 产β-葡聚糖酶链霉菌菌株的筛选及其酶特性研究[J].烟台师范学院学报（自然科学版）2004,20(1),58-61.

[5]孙玉英，王瑞明，刘庆军.局限曲霉产β-葡聚糖酶发酵培养基和发酵条件的优化[J].饲料工业，2004, 25(1): 29-30.

[6]孙玉英，王瑞明，刘庆军.局限曲霉产β-葡聚糖酶发酵培养基和发酵条件的优化[J].饲料工业，2004, 25(1): 29-30.