载体介导的RNAi抑制乙肝病毒S基因的研究

周豪杰，汪传喜，滕 青，聂咏梅

（广州血液中心质量控制科，广东 广州 510095）

载体介导的RNAi抑制乙肝病毒S基因的研究

周豪杰，汪传喜，滕 青，聂咏梅*

（广州血液中心质量控制科，广东 广州 510095）

目的构建针对乙肝病毒S基因的RNAi表达载体，观察其对HBV表达的影响。方法合成针对HBV S基因的RNAi寡核苷酸，克隆入pSUPER载体，与pHBV质粒共转染HepG2细胞。ELISA和Western blot检测HBsAg表达。结果成功构建针对HBV S基因的RNAi表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2对HBsAg的抑制率分别为79.0%和43.2%，无关序列的RNAi表达载体无此作用。结论载体介导的RNAi能高效、特异地抑制HBV S基因的表达。

乙型肝炎病毒；RNA干扰；乙肝病毒表面抗原

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一种嗜肝DNA病毒，可引起人体急性和慢性肝炎，是危害人类健康的一个重大疾病[1]。目前慢性乙肝的治疗主要采用干扰素和拉米夫定等抗病毒药物，但迄今疗效并不令人满意[2]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发展的一种基因疗法，表现在转录后水平特异地引起基因沉默[3]，目前RNAi已经被广泛的用于基因治疗研究。我们针对HBV S基因尝试构建RNAi表达质粒，观察其对HBV表面抗原表达的影响。

1 材料与方法

1.1 质粒和细胞 RNAi表达载体pSUPER购自美国Oligoengine公司，稳定表达HBsAg的全长HBV真核表达载体pHBV由本实验室构建[4]。HepG2细胞、DH5α大肠杆菌由本实验室保存。

1.2 主要试剂 高糖DMEM细胞培养液购自Gibco公司，HBsAg ELISA检测试剂盒购自法国梅里埃公司，脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，鼠抗HBsAg单抗购自ViroStat公司，羊抗鼠IgG二抗为武汉博士德公司产品，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。

1.3 针对HBV S基因RNAi表达载体的构建 根据RNAi的设计原则[5]，选择HBV序列357-375及520-538位点设计两对寡核苷酸S1和S2，同时设计一对无关序列Snonsense，在其两端分别加上BglⅡ和HindⅢ酶切位点，TTTTT为转录终止信号，loop环为TTCAAGAGA，设计序列见表1。寡核苷酸序列交由上海生工合成后，溶解于水中成浓度1 μg/μl，各取2 μl混匀，加入6 μl退火缓冲液，95℃保温5 min，自然冷却至室温得到退火双链DNA；取10 μl退火双链DNA及经BglⅡ和 HindⅢ双酶切的pSUPER载体3 μl、T4DNA连接酶2μl，连接缓冲液2 μl、H2O 3 μl 16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌。提取质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性克隆送测序。

表1 乙型肝炎病毒S基因干扰寡核苷酸序列

1.4 细胞培养和转染 HepG2细胞用含10%新生牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的高糖DMEM培养液，按2×l05细胞/孔接种6孔板，于37℃、5%CO2培养箱中培养。设四个组：pHBV对照组，S1处理组，S2处理组和Snonsense组，每组设置6复孔。细胞融合85%左右，脂质体介导转染细胞，pHBV对照组转染0.5 μg pHBV载体，处理组共转染0.5 μg pHBV载体和0.5 μg RNAi干扰载体。

1.5 培养上清HBsAg检测 细胞转染后48 h收集培养上清进行HBsAg ELISA检测，以620 nm为参考波长，450 nm为测量波长读取吸光度A值，并计算抑制率，抑制率=(A试验组-A对照组)／A对照组×100%。

1.6 Western blot检测HBsAg表达 细胞转染后48 h收集细胞，加上样缓冲液煮沸5 min裂解进行SDS-PAGE，蛋白样品分离后电转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭1 h，依次加入鼠抗HBsAg单抗(1:1 000稀释，4℃孵育过夜)，HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1:2 000稀释，室温1h)，TMB显色，拍照记录。

2 结果

2.1 RNAi表达载体的鉴定 重组质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，产生约3000 bp和290 bp两个片段，空质粒产生3 000 bp和230 bp两个片段(图1)，与预期相符，进一步DNA测序证实针对HBV S基因的RNAi表达载体构建成功。

图1 RNAi表达载体的双酶切鉴定

图2 Western blot检测HBsAg表达

2.2 培养上清HBsAg ELISA检测 ELISA检测培养上清HBsAg及抑制率见表2。

表2 培养上清HBsAg ELISA检测

2.3 Western blot检测HBsAg表达 Western blot结果见图2：pSUPER-S1和pSUPER-S2组和对照组pHBV相比较，HBsAg表达均有下降，pSUPER-S1组下降更明显；而pSUPER-Snonsense组HBsAg表达基本无变化。

3 讨 论

RNAi的概念于1998年由Fire提出[3]，是一种在转录后水平特异地引起基因沉默的现象。RNAi作用具有序列特异性，最终导致同源mRNA的降解，因此RNAi主要被应用于抗HIV、HCV等RNA病毒的研究，并且取得了较为理想的效果。HBV是一个DNA病毒，但其复制过程中存在从前基因组RNA逆转录到DNA的重要环节，研究表明RNAi也可以有效作用于HBV，通过切割前基因组RNA和其他转录本mRNA，从而阻断HBV的表达和复制[6]。

本实验以HBV S基因为靶点，构建了RNAi表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2，对细胞培养上清中HBsAg的抑制率分别为79.0%和43.2%，无关序列RNAi干扰载体未观察到抑制作用，Western blot结果与细胞上清检测相一致，表明针对HBV S基因的RNAi干扰载体能高效并且特异地抑制HBV S基因的表达。pSUPER-S1对靶基因的抑制作用要显著强于pSUPER-S2，可能与干扰位点的选择以及siRNA的靶向偏离作用有关[7]，提示pSUPER-S1的对应序列可以作为抗HBV的一个备选靶位。

RNAi的出现为HBV慢性肝炎的治疗提供了新的思路，但要实际应用仍有问题亟待解决：靶位选择，RNAi不能达到对HBV百分之百的抑制，可能需要联用其他治疗手段[8]；RNAi如何导入人体器官；最重要的是安全性问题，如何避免脱靶甚至“误伤”的发生[7]。因此，对于RNAi抗HBV的研究，现在仍处于实验阶段，但其作用的高效性和特异性，提示RNAi作为一种高效抗病毒基因疗法的巨大潜能。

[1]Kao JH，Chen DS.Global control of hepatitis B virus infection[J].Lancet Infect Dis,2002,2(7):395-403.

[2]Seeger C，Mason WS.Heptitis B virus biology[J].Microbiol Mol Bio Review，2000，64(1):51-68.

[3]Fire A,Xu S,Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[4]周豪杰,聂咏梅,付涌水,等.乙肝病毒全长基因组真核表达载体构建[J].热带医学杂志,2007,7(11):1071-1072.

[5]Reynolds A，Leake D，Boese Q，et a1.Rational siRNA design for RNA interference[J].Nat Biotechnol，2004，22(3)：326-330.

[6]孔令波，佟立新，王锡育.RNA干扰技术在抗乙型肝炎病毒感染应用中的研究进展[J].世界华人消化杂志，2009，17(13):1 324-1 328.

[7]Yoshinari K，Miyagishi M，Taira K.Effects on RNAi of the tight structure,sequence and position of the targeted region[J].Nucleic Acids Res，2004，32(2):691-699.

[8]Huang Z,Salazar FH,Xu H,et a1.Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNAinterference[J].Nat Biotechnol,2003,21(6):639-644.

Inhibitory efects of vector-based RNAi on S gene expression of hepatitis B virus.

ZHOU Hao-jie,WANG Chuan-xi,TENG Qing,et al.Department of Quality Control,Guangzhou Blood Center,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo construct RNAi expressing vectors targeting HBV S gene and to evaluate the inhibitory effects on HBV replication.MethodsTwo sequences targeting HBV S gene were cloned into pSUPER vector and then were cotransfected with pHBV into HepG2 cells.HBsAg expression was assayed by ELISA and Western blot.ResultsPSUPER-S1 and pSUPER-S2 RNAi expressing vectors were successfully constructed and inhibited HBsAg in HepG2 cells by 79.0%and 43.2%,Whereas irrelevant RNAi expressing vector did not show inhibitory effects on the HBsAg expression.ConclusionVector-based RNAi can inhibit HBV replication effectively and specifically.

Hepatitis B virus;RNAinterference;HBsAg

R373.2+1

A

1003—6350（2010）20—004—03

2010-06-10）

广州市医药卫生科技一般引导项目(编号：2007-YB-137)；广东省自然科学基金项目（编号：04000793）

周豪杰（1978—），男，广东省广州市人，主管技师，硕士。

*通讯作者：聂咏梅。E-mail：manieyongmei@yahoo.com.cn