粗寡核苷酸的纯化方法现状及进展

陶 炜

（美亚药业海安有限公司，江苏南通 226601）

寡核苷酸是一种20～30个碱基左右的短链核苷酸，可以用于DNA 测序、PCR 扩增、基因检测、反义核苷酸研究等领域。以寡核苷酸为基础的反义技术是迄今为止实现抑制或消除遗传信息的最常见和最成功的方法[1]。合成寡核苷酸序列的反义效应在20世纪70年代末首次被Zamecnik 和Stephenson 证明。扎米尼克和斯蒂芬森利用劳斯肉瘤病毒（RSV）35S RNA 的5'端和3'端核苷酸序列，确定了21个重复序列，这些重复序列对病毒整合至关重要。他们合成了一个13碱基的寡核苷酸（AATGGTAAAATGG）是该病毒序列的一部分。将合成的寡核苷酸序列导入感染RSV的成纤维细胞中，可显著抑制病毒的产生。他们正确地得出结论，寡核苷酸通过与关键序列杂交并阻断它们来抑制病毒整合并用杂交来描述这种寡核苷酸。

1 寡核苷酸概述

1.1 寡核苷酸的概念

寡核苷酸通常是由20个以内短链核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸）组成，是短RNA 或DNA低聚体，简单地说，就是数量较少的几个碱基聚合在一起的核苷酸。寡核苷酸具有多种引物长度，可采用预设计、定制或随机形式，在微阵列、凝胶迁移分析、人工基因合成、PCR、DNA 测序、分子克隆、法医学和其他研究中应用。当前研究寡核苷酸种类很多，包括药物，例如反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸、微小核糖核酸、核酸适配体等。寡核苷酸可以通过Watson-Crick 碱基互补配对原理与DNA、mRNA或者pre-mRNA 配对而实现非常高的选择性，精准地抑制某些基因，让编码异常的基因保持“沉默”，从而阻止许多“错误”的蛋白质表达。寡核苷酸既可以自然形成也可以人工合成。

1.2 寡核苷酸的物化性质

影响寡核苷酸理化性质的因素主要是寡核苷酸的化学修饰。寡核苷酸的化学修饰主要是5'端和3'端核苷酸序列。寡核苷酸与DNA 或RNA 发生双链作用时，能够进行非互补链的置换，达到抑制转录因子结合的目的。另外，寡核苷酸还能够合成DNA，用于链聚合反应，将DNA 的片段放大。在聚合反应的过程中，将DNA 中发生标记的片段与用于核酸扩增的化学修饰的寡核苷酸引物结合，形成DNA 的复制品。

1.3 寡核苷酸的应用

寡核苷酸可用于药物探索和开发中、用于诊断测试中、用作研究剂（诸如聚合酶链式反应（PCR）中的引物或探针）、用作靶标验证中的反义剂、用作转录因子的竞争性抑制剂、用作核酶、用作适体、用作免疫系统的刺激物或用作治疗疾病的生物治疗剂[2]。具体用途如下：

（1）寡核苷酸引物和探针

合成寡核苷酸最普遍的用途是在各种应用中用作相对较短的探针和引物（最多30个聚体）。这涉及合成与较大的靶DNA 或RNA 链（靶序列）成对或“反向互补”的核苷酸序列。作为引物，寡核苷酸通常用于引发酶促反应（例如：寡糖），以生成短或长靶序列的数百万至数十亿个副本，如聚合酶链反应（PCR）或Sanger 测序方法。寡核苷酸引物的应用包括DNA测序、基因表达、克隆和分子诊断。

作为探针，寡核苷酸用于鉴定以及结合特定的DNA 或RNA 靶序列，以确认该序列在特定材料中的存在。使用寡核苷酸探针的应用包括印迹程序，例如Northern 印迹（用于RNA）或Southern 印迹（用于DNA），作为微阵列中的荧光团偶联序列，可检测基因表达的变化，或者用于筛选遗传疾病或鉴定特定病原体（分子诊断）。

（2）寡核苷酸治疗/基因治疗

在治疗应用中，反义寡核苷酸（ASO）（通常为20～30个聚体物种）利用自然生物学促进对不良或过度活跃RNA 序列的基因抑制或基因沉默（破坏），从而阻止对有可能造成或诱发疾病的某些受损或过度活跃蛋白质的表达。关于基于寡核苷酸疗法的研究已经明显加强，近年来已经批准了多种药物。

1.4 寡核苷酸的合成

寡核苷酸的合成方法有固相技术法、亚磷酸三酯法，合成步骤如下[3]：

第一步：脱保护基。利用三氯乙酸有机溶剂，将双核苷酸的DMT 保护基团脱去，从而得到游离状态的5′-羟基端，以便于进行后续的缩合反应。

第二步：活化。为了得到3′-端被活化、受DMT 保护的5′-端的有活性的中间体亚磷酰胺四唑，将四氮唑活化剂与核苷酸单体保护物质亚磷酰胺进行混合，然后加入到合成柱内，目的是保证中间体亚磷酰胺四唑能够与脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

第三步：连接。当进行缩合反应时，一旦中间体亚磷酰胺四唑保持活性，则与脱保护基的核苷酸游离状态的5′-羟基端发生亲和反应，使亚磷酰胺四唑的四唑脱去，同时又增加了一个碱基在寡核苷酸链上。

第四步：封闭。为了避免未发生亲和反应的5′-羟基端发生后续反应连接在寡核苷酸链上，利用乙酰化手段将该5′-羟基端封闭。

第五步：氧化。核苷酸单体在发生缩合反应时，利用亚磷酯键，完成寡核苷酸的连接，但是由于亚磷酯键化学性质不稳定，容易发生酸碱分解反应，为了得到稳定的寡核苷酸，避免亚磷酯键被分解，通常选择碘的四氢呋喃溶液。

2 粗寡核苷酸的纯化方法现状

寡核苷酸可以化学合成以用于研究和医学目的的短DNA 或RNA 寡聚体。寡核苷酸通常通过以下方式制备：逐步添加核苷酸残基以产生特定序列。在合成过程中，任何步骤的低效都是可能的，导致寡聚体缺失核苷（“N-1杂质”）或具有磷酸二酯键而不是所需的硫代磷酸酯键（“P=O 杂质”）。另外，在合成期间或之后暴露于氧化条件可以将P=S 键转化为P=O键以形成P=O 杂质。完成所需序列的寡核苷酸的合成后，目标寡核苷酸被作为与所有失败的序列和N-1杂质和P=O 杂质的混合物获得。然后需要将这些杂质与目标寡核苷酸分离。目前寡核苷酸的纯化方法大致可以分为两种：

（1）寡核苷酸合成过程中的影响因素是寡核苷酸质量和长度，因此，为了确保寡核苷酸能够正常合成，需要在合成过程中控制寡核苷酸的质量以及长度。以寡核苷酸分离方法为基础研究可知，现有寡核苷酸质量和长度的控制方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术和高效液相色谱（HPLC）技术，都是基于不同长度的寡核苷酸在介质中移动的速度差异分离出目标寡核苷酸。这两个方法的通量都不高。

①聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是一种高效的纯化引物和分析合成过程的方法。聚丙烯酰胺凝胶电脉分离的依据是分子在电场中的迁移率不同和丙烯酰胺胶的分子筛效应。分离寡核甘酸一般用变性胶，较好地排除了分子形状对迁移率的影响，因此迁移率主要决定于分子的质量和电荷之间的比值，在一定的pH 下，此值与寡核甘酸分子量的常用对数成正比。该方法分离精度高，相差一个碱基的寡核甘酸分子也能得到很好的分离。电泳分离之后直接用紫外照射，以硅胶荧光板为背景，可以清楚地显现条带。此纯化方法无长度等限制，所得产品可以满足最苛刻的分子生物学实验要求。此外通过电泳显带，还能分析合成的过程，以代替分步收集DMT 阳离子进行分析的传统方法。PAGE 纯化的缺点是费时、费人力，劳动强度也较高。此方法为绝大多数分子生物学实验者所采用。

②高效液相色谱（HPLC）技术。高效液相色谱法是当前分离纯化寡核苷酸的主要方法，分离纯化的指标是目标物和杂质的分离度，现有高效液相色谱法方法中使用TEAB 作为离子对试剂，对寡核苷酸进行分离纯化，该方法又称反相离子对色谱法。由于TEAB 的保留性能一般，所以目标物与杂质之间的分离度较差。寡核苷酸不能得到真正有效的分离，对于一些缺少一个碱基的片段的杂质，经常会和目标物共流出，从而影响纯度导致下游应用效果变差。

（2）基于DMT 基团的特异性吸附，目标寡核苷酸在合成最后一个碱基后可以选择性地带有DMT 基团，而提前中止的寡核苷酸不带这个基团，这种差异可以被特异性结合DMT 基团的介质识别，从而只收获目标寡核苷酸。这个方法通量较高，但只适合于较短的寡核苷酸，而且在纯化后还需要加一步去除DMT 基团的操作。如果合成的寡核苷酸质量很高，也可以直接脱盐纯化，即只去除非DNA 的杂质，不会对下游操作产生太大的影响。

①OPC 柱纯化。OPC 柱纯化是专为合成引物的纯化而设计的纯化小柱，利用柱料和合成的引物5′-端DMT 的亲和力来特异吸附含DMT 的寡核甘酸分子，因此在合成后的后续处理时，应注意不要脱掉DMT，在纯化的过程中再脱此基团。从合成过程可以知道，只有合成的寡核甘酸链的最后一个碱基，即5′-末端上有DMT 基团，所以该方法可以高效的去掉盐分、短片段，纯化后的产物可达到较高的纯度，可用于大多数的分子生物学实验。该方法高速（15～20min）、高效，可实现自动化。但该方法受长度限制，当需要纯化的寡核甘酸链长度超60bp 时，需要作特殊的处理；其次，受柱容量的限制，只能纯化10～20OD 粗产物，纯化后1～5OD。另外，当实验对oligo 的纯度要求较高时，很难达到要求。

②脱盐纯化。化学合成寡核苷酸目前多采用高通量合成仪合成，合成每批次一般有96或384个。脱盐纯化是利用C18柱的强疏水作用对寡核苷酸进行特异性吸附，利用有机溶液达到洗脱目的，实现分离纯化。根据各种分子极性的不同从而达到分离效果，能有效地去掉盐分，不能去除短片段，是一种快速、简便的脱盐方法。脱盐后的寡核甘酸可用作普通的PCR 的引物、杂交探针等用途，不适合作为测序引物，也不适用于克隆表达等进一步用途的PCR 的引物。

以上几种方法都是基于物理或化学的方法来分离目标寡核苷酸，在通量和分离效率上都有一定的局限。生物酶通常具有高效、专一的特点，核酸酶是其中专门水解核酸的蛋白质的总称，根据其作用底物的不同，存在不同的分类。RNA 酶和DNA 酶分别作用于RNA 和DNA；双链核酸酶和单链核酸酶分别作用于双链核酸和单链核酸；内切酶作用于核酸序列的内部，而外切酶则作用于核酸序列的两端。其中外切酶根据其作用方向的不同，又可分为5’-3’外切酶和3’-5’外切酶。

3 粗寡核苷酸的纯化方法进展

合成核苷酸的未来用途是了解DNA 和RNA 疫苗的形式。尽管不是严格意义上的寡核苷酸，但是长度为数百或数千个碱基的基于DNA 或RNA 的疫苗产品（如mRNA 或质粒或基于载体的核酸）代表着不断发展的合成核苷酸技术的前沿。从概念上讲，DNA 或RNA 疫苗将免除病原细菌或病毒的所有不必要或有害部分。相反，这种基于核酸的疫苗将仅包含病原体DNA 或RNA 少数部分的代码。这些DNA 或RNA 链将指导患者的免疫系统产生单个抗原或病原体片段。通过现代化运算和计算机模拟，只要存在设计时参考的适当靶序列，便可以在数日或数周内创建这些寡核苷酸疫苗形式。作为一种平台技术，基于核酸的疫苗依赖于成套标准构件或原材料，可随心所欲地实现多种组合。因此与传统疫苗形式相比，它们相对便宜且易于生产。

然而，对于生物制药行业而言，这仍然是一种正在成熟的范式，并且正在不断解决新的挑战，其中一些挑战是寡核苷酸和长核酸产物所独有的，而一些挑战则与其他生物治疗形式共有。寡核苷酸的纯化及表征是目前制药行业的一大热点。然而，寡核苷酸的表征，特别是通过离子对反相液相色谱（IP-RPLC）进行表征，则非常具有挑战性。随着寡核苷酸的纯化方法的发展以及新用途，研究了寡核苷酸纯化方法包括反相高效液相色谱（RP-HPLC）或具有基于二氧化硅或聚合物颗粒的固定相的离子交换色谱技术。

1）反相高效液相色谱。对于RP-HPLC 纯化方法，5'-O-三苯甲基保护基通常用于在合成过程中保护合成寡核苷酸的5'-羟基，然后用于从不具有5'-O-三苯甲基保护基的较短的失效序列（“三苯甲基ON”序列）纯化全长寡核苷酸序列）（“三苯甲基ON”序列）。然而，这样的方法需要额外的步骤以在纯化后除去三苯甲基保护基，这增加了整个纯化的成本和时间。大规模RP-HPLC 纯化过程也可能是昂贵的，因为大量使用有机溶剂和需要高度专用的设备来处理高压需求。

2）离子交换色谱技术。离子交换色谱技术常用于纯化天然和合成的寡核苷酸。用于离子交换色谱技术的放大纯化比RP-HPLC 方法成本低得多，并且压力要求低得多。已经在分析和制备规模上使用离子交换层析成功地分离了寡核苷酸。然而，可形成四链体二级结构的富含鸟嘌呤的寡核苷酸由于其庞大的尺寸和电荷，可在阴离子交换固定相上表现出广泛的保留，并且在一些情况下与阴离子交换固定相不可逆地结合，从而使得通过阴离子交换色谱法纯化这些富含鸟嘌呤的寡核苷酸变得困难或不可能。

4 结语

随着全球寡核苷酸治疗药物市场的增长，使用适当的手段对寡核苷酸进行纯化和放大是必不可少的。通过对寡核苷酸的性质和应用了解与概括，研究讨论了有关寡核苷酸纯化方法现状和存在的问题，并提出解决方案，旨在满足市场的复杂需求，促进寡核苷酸合成行业的发展。