氮添加对青藏高原高寒草甸丛枝菌根真菌群落的影响

摘要：丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能与大部分高等植物的根系形成共生关系，进行重要的物质和能量交换，而氮添加会对AMF产生一系列影响。本试验以高寒草甸为研究对象，探究4个不同氮添加水平下土壤AMF群落的变化特征及土壤驱动因子。研究表明：（1）N5和N10处理下，土壤pH值显著降低，N10处理下，土壤硝态氮含量显著上升。（2）在N5和N15处理下，多样孢囊霉科（Diversisporaceae）群落相对丰度显著降低，（3）在N5和N10处理下，Chao1指数显著降低，在N10和N15处理下，β多样性有显著变化。（4）土壤铵态氮，硝态氮和有机碳含量是影响AMF群落结构的关键因子。因此，氮添加会影响青藏高原高寒草甸土壤AMF群落，且群落结构和丰度与土壤特性显著相关，研究结果对于预测全球大气氮沉降背景下青藏高原高寒草甸土壤AMF多样性的未来变化具有重要意义。

关键词：氮添加；AMF；土壤化学成分；群落组成；多样性

中图分类号：S153.6""" 文献标识码：A""""" 文章编号：1007-0435（2024）07-2054-08

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.006

引用格式：

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GUO Xian-bao， HAN Bing， HE Yi-cheng，et al.The Effects of Nitrogen Addition on Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Alpine Meadow of The Qinghai-Tibetan Plateau［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2054-2061

收稿日期：2024-03-15；修回日期：2024-04-23

基金项目：国家自然科学基金面上项目（32171685）资助

作者简介：

国显宝（2003-），男，汉族，辽宁朝阳人，本科生，主要从事草地生态学研究，E-mail：15114204093@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：shaoxinqing@163.com

The Effects of Nitrogen Addition on Arbuscular Mycorrhizal Fungal

Communities in Alpine Meadow of The Qinghai-Tibetan Plateau

GUO Xian-bao1， HAN Bing1， LU Xin-min2， HE Yi-cheng1， YU Lu1， ZHANG Wan-tong1，

DUAN Li-hui1， GENG Yi-yi1， SHAO Xin-qing1*， YU Dian1， HAN Jia-yi1

（1. College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China;

2. Tianshui Fruit Research Institute， Tianshui， Gansu Province 741000， China）

Abstract：Arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） can form symbiotic relationship with the roots of most higher plants，and exchange important materials and energy. Nitrogen addition has a series of effects on AMF. Taking alpine meadow as the research object，change characteristics of AMF community and soil driving factors under four different nitrogen addition levels were studied. The results showed that：（1） Under the treatments of N5 and N10，soil pH decreased significantly，while under the treatment of N10，soil nitrate content increased significantly. （2） Under N5 and N15 treatments，the relative abundance of Diversisporaceae community decreased significantly;（3） Under N5 and N10 treatments，chao1 index decreased significantly;under N10 and N15 treatments，β diversity changed significantly;（4） The contents of soil ammonium nitrogen，nitrate nitrogen and organic carbon were the key factors affecting the community structure of AMF. Therefore，nitrogen addition affected the AMF community of alpine meadow soil in Qinghai-Tibet Plateau，and the community structure and abundance were significantly related to soil characteristics. The research results are of great significance for predicting the future changes of AMF diversity in alpine meadow of Qinghai-Tibet Plateau under the background of global atmospheric nitrogen deposition.

Key words：Nitrogen addition;Arbuscular mycorrhizal fungi;Soil chemical composition;Community composition;Diversity

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤共生真菌中分布最广的一类真菌［1］，在长期的进化过程中，与宿主植物形成了依赖于碳水化合物与矿质养分交换的专性共生体［2］。具体表现为，AMF的根外菌丝可以作为根系的延长部分，帮助宿主植物吸收氮、磷、钾等必需营养成分［3］，作为交换，宿主植物为AMF提供碳水化合物和脂类，用以扩大菌丝网络［4］。此外，AMF还可以提高宿主植物对外界胁迫（如干旱、盐碱等）的抗性［5］。AMF具有丰富的物种多样性，Morton等［6］根据AM真菌孢子的形态特征将所有AMF分类为新建立的球囊霉目（Glomerales），之后Schüβler等［7］以SSU rRNA基因序列研究为基础，将球囊霉目提升到球囊菌门（Glomeromycota），其中包含1个纲、4个目、7个科、9个属，建立起了AMF的最初分类系统（CABI Bioscience，UK，2004；INVAM，USA，2004）。我国迄今已发现146种AMF （约占全球已报道总数的60%），其中包括13个新种［8］。

青藏高原60%以上面积为草地所覆盖，其主要植被类型是以冷中生多年生草本植物群落为主构成的高寒草甸［9］，氮素是限制其生态系统初级生产力的关键营养元素［10］，因此，施加氮肥是高寒草甸中常见的养分管理措施之一［11］，能够及时补充土壤营养元素，有助于恢复和提高退化草地生产力等服务功能［12］。一项在川西北高寒草甸的研究发现［13］，氮添加显著增加了禾本科功能群的盖度和重要值，提高了各功能群的植物高度，显著降低了杂类草植物的物种数、盖度和重要值。杨晓霞等［14］在对青藏高原高寒草甸的研究发现虽然氮添加能显著增加植物地上生物量，但对地下生物量和总生物量无显著影响。此外，有研究表明［15］，在青藏高原，氮添加不增加土壤总有机碳，但增加土壤矿质化碳。

关于氮添加对AMF的影响，研究发现高寒草甸生态系统中AMF孢子密度和根系定殖率在适量的氮添加下达到峰值［16］，表明一定的氮添加有利于AMF的定殖。对AMF多样性的影响上，目前尚无一致的结论，大部分研究发现氮沉降对AMF丰富度和多样性有显著负面影响［17-19］，但也有研究发现氮添加对AMF群落多样性没有影响［20］或增加AMF多样性［21］。研究结果不同可能与多种因素如土壤状况、海拔、气候等有关。一般来说，当土壤养分限制减轻，植物会把更多的碳资源分配给地上部分［22］，导致地下菌根生物量减少［23］。当前，有关养分添加（主要是氮和磷） 能否及如何影响高寒草甸AMF群落组成及多样性的研究较少，因此本研究以青藏高原高寒草甸为研究对象，通过在野外定位试验平台上实施氮添加的试验处理，采用高通量测序技术，探究不同氮添加水平下土壤AMF多样性和群落组成，以及土壤化学成分的改变与AMF群落之间的关系，了解调控高寒草甸AMF变化的机制，为预测全球大气氮沉降背景下青藏高原高寒草甸土壤AMF多样性的未来变化提供理论依据。

1" 材料与方法

1.1" 研究区概况

养分添加试验地位于青海省海晏县西海镇（36°92′N，100°93′E），建立于2019年6月，依托青海省海北州高原现代生态畜牧业科技试验示范园。海拔高度为3 000～3 100 m，高原大陆性气候，雨热同期，夏季凉爽湿润，冬季寒冷干旱，全年日照总长大约有2 580 h。年平均降水有400 mm，主要集中在6—8月。年均温为1.5℃，试验地的草地类型属于高寒草甸草原，土壤为粘壤土，样地中的主要植物种类有针茅（Stipa aliena）、赖草（Leymus secalinus）、洽草（Koeleria macrantha）、冰草（Agropyron cristatum）、扁蓿豆（Melissitus ruthenica）等。

1.2" 试验设计

于2019年6月，在养分添加试验地设置三个氮添加水平，分别为5，10和15 g·m-2·a-1，记为N5，N10和N15，加上对照（CK：0 g·m-2·a-1），共4个处理，每个处理设置4个重复，总计16个小区，每个小区的大小为3 m×4 m各小区之间设置1 m的间隔。养分添加的处理安排在每年草地的返青期（6月初），氮添加以尿素（N含量46%，购自泸天化股份有限公司）的形式每年施入一次。在试验期间，样地周围有围栏围护，采用封闭管理。

1.3" 取样方法

在连续施肥两年后的生长高峰期（2020年8月初），使用土钻（直径5 cm）在各小区内取0～10 cm的土样，各小区重复取样5次。土壤样品分两份，1份充分混合后过粗筛（2 mm），筛去根系和大块土粒，风干后常温保存，用于测定土壤化学成分：土壤全磷（Total Phosphorus，TP）、全碳（Total carbon，TC）、全氮（Total nitrogen，TN）、PH值、硝态氮（NO-3-N）、铵态氮（NH+4-N）和土壤有机碳（Soil organic carbon，SOC）；1份液氮冷冻，24 h内运至实验室，保存至-80℃冰箱进行后续AMF群落分析。

1.4" 土壤化学成分的测定

土壤全磷测定采用钼锑抗比色法测定，土壤全碳和全氮通过碳氮元素分析仪（Elementar，Hanau，Germany）测定。用 1 mol KCl（土水比为1∶5）的土壤提取液，使用pH计（Orion Star A215 PH Meter，US）测定土壤pH值。土壤硝态氮和铵态氮的浓度由流动分析仪（Flowsys，Ecotech，Germany）测定。土壤有机碳用浓盐酸熏蒸8 h后，用有机碳分析仪（Vario Macro，elementar，Germany）测定。

1.5" DNA提取和PCR扩增测序

使用E. Z. N. A. soil DNA kit（Omega Biotek，Norcross，GA，USA）从土壤样品中提取微生物DNA。采用PCR（BioRad S1000，Bio-Rad Laboratory，CA）扩增真菌18S rRNA基因，引物为AMV4.5 NF/AMDGR（5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′/5′-CCCAACTATCCCTATTAATCA T-3′）。PCR反应混合物使用TruSeq Nano DNA Gel Extraction Kit（Illumina，美国）纯化，使用Agilent Bioanalyzer 2100系统（Agilent，美国）定量。测序工作委托派森诺生物科技有限公司完成。按照NEB（New England Biolabs，USA）的标准程序生成测序文库，最终在Illumina Hiseq 2500平台上进行配对测序。

1.6" 数据分析

对土壤化学成分各个数据进行Z-score转化，并使用R包ggplot绘制热图，使用最小显著性差异法比较不同处理间的差异显著性（α=0.05），以评估氮添加对土壤化学成分的影响。利用QIIME2 （version 2019.4）对Illumina MiSeq测序数据生成α-多样性指数（Chao1、Faith_pd、Simpson和Shannon）。利用R （4.1.3）对不同处理下AMF相对丰度和群落α-多样性指数进行单因素方差分析和作图表，以比较不同氮添加水平对AMF群落多样性的影响。对于β-多样性分析，计算了Bray-Curtis距离，并使用R（4.1.3）中的“vegan”软件包进行主坐标分析（PCoA）。土壤化学成分和AMF群落的冗余分析（RDA）使用免费的在线数据分析平台genescloud工具（https：//www.genescloud.cn）进行。person相关分析用于比较土壤化学成分和AMF各科的相关性，通过R（4.1.3）中的ggplot2包绘制相关分析热图。

2" 结果与分析

2.1" 不同氮添加水平对土壤化学成分的影响

不同氮添加水平对土壤化学成分的影响不同（图1），相较于CK，N15添加下土壤全磷含量显著降低（Plt;0.05）。土壤pH值在N5和N10处理下显著降低（Plt;0.05）。随着氮添加水平的提升，土壤SOC含量增加但不显著；相较于CK，N10添加下土壤硝态氮含量显著增加（Plt;0.05）。土壤铵态氮含量随着氮添加量的添加先上升后下降，但变化不显著。

2.2" 不同氮添加水平对丛枝菌根真菌群落组成和丰度的影响

对AMF群落结构组成分析结果表明（表1），土壤在科水平上的优势科为类球囊霉科（Paraglomeraceae）和球囊霉科（Glomeraceae），其次是巨孢囊霉科（Gigasporaceae）、近明球囊霉科（Claroideoglomeraceae）、多样孢囊霉科（Diversisporaceae）、原囊霉科（Archaeosporaceae）、双型囊霉科（Ambisporaceae）。

不同氮添加水平对不同AMF种类相对丰度影响不同（表1），与CK相比，在N5和N15处理下，多样孢囊霉科（Diversisporaceae）群落相对丰度显著降低（Plt;0.05）。随着氮添加水平的增加，类球囊霉科（Paraglomeraceae），近明球囊霉科（Claroideoglomeraceae）相对丰度变化不显著，球囊霉科（Glomeraceae），巨孢囊霉科（Gigasporaceae），原囊霉科（Archaeosporaceae），双型囊霉科（Ambisporaceae）相对丰度呈现先上升后下降的趋势，但变化不显著。

2.3" 不同氮添加水平对丛枝菌根真菌群落多样性的影响

对α多样性进行分析，以Chao1和Pielou_e指数表征群落物种丰富度，Shannon和Simpson指数表征群落物种多样性。由图2（a）～2（d）可知，随着氮添加水平的增加，不同处理之间，Shannon，Pielou_e，Simpson指数变化不显著;在N5和N10处理下，Chao1指数显著降低（Plt;0.05）。对β多样性进行分析，由图3所示，相较于对照，N5处理下，AMF群落多样性差异不显著，而在N10和N15处理下，AMF群落多样性差异显著（Plt;0.05）。

2.4" 不同氮添加水平丛枝菌根真菌与土壤化学成分的相关分析

在科分类水平上，将不同氮添加处理下土壤AMF群落结构组成与8个环境因子（全氮、全碳、全磷、pH值、碳氮比、硝态氮、铵态氮、有机碳）进行RDA分析。结果如图4所示，土壤铵态氮，硝态氮，有机碳含量是影响AMF群落结构的关键因素（Plt;0.05）。

将不同氮添加处理下土壤AMF群落各科相对丰度与土壤化学成分（铵态氮、硝态氮、pH值、有机碳、全碳、全氮、全磷）进行相关分析，结果如图5，球囊霉科（Glomeraceae）丰度与土壤全氮含量呈显著正相关关系；巨孢囊霉科（Gigasporaceae）丰度与土壤铵态氮呈显著正相关，与硝态氮和全磷含量呈显著负相关；原囊霉科（Archaeosporaceae）丰度与土壤硝态氮含量呈显著负相关；双型囊霉科（Ambisporaceae）丰度与土壤全碳，全氮含量呈显著正相关关系（Plt;0.05）。

3" 讨论

前人的研究已证实高寒草甸生态系统中氮是主要限制因素［24］，而氮添加引起土壤氮可利用性上升，将对AMF共产生一系列显著影响。本研究通过探究不同氮添加水平下土壤化学成分和AMF的变化规律及其关系，为预测全球大气氮沉降背景下青藏高原土壤AMF多样性的未来变化提供理论依据。

3.1" 不同氮添加水平对土壤化学成分的影响

本研究中，不同氮添加改变了土壤的性质。首先，在N15处理下，氮添加会显著降低土壤全磷的含量，这与草地生态系统原位氮添加试验的结果一致［25］。在氮添加的条件下，土壤pH值降低促进无机磷溶解为植物可利用的有效磷，但植物的生物量增加，对土壤中磷的吸收增加，因此，土壤中全磷的含量降低［26］。本研究中，在N5和N10处理下，pH值均显著降低，表明氮添加会使土壤酸化，这与多数氮添加试验结果一致［27-29］。随着氮的添加，硝化反应等作用下产生的氢离子与土壤胶体表面吸附的盐基离子发生交换，导致氢离子吸附聚集在土壤胶体表面［30］，改变植物对离子的吸收以及改变土壤中盐基离子浓度从而导致土壤的酸化［31］。土壤SOC是土壤极其重要的组成部分，对地球的碳循环有重大的影响［32］。本研究的氮添加下，土壤SOC的含量呈现增加趋势。关于氮添加对土壤SOC的影响的研究，目前结论不一致，有研究表明，当微生物长期处于酸性环境中会调节自身代谢过程，改变对土壤养分的吸收，维持生物量的碳氮比，进一步影响土壤的碳氮平衡［33］。也有研究表明，氮添加虽然使土壤SOC含量无明显差异，但土壤有机碳各组分的相对含量发生改变［34］，氮添加对碳组分含量的不同影响可能与养分添加量、试验地原有的养分有效性以及植被类型有关。

3.2" 不同氮添加水平对丛枝菌根真菌群落的影响

相对丰度反映了一定环境条件下物种的组成。本研究中，多样孢囊霉科（Diversisporaceae）相对丰度在N5和N15处理下显著降低，这可能与多样孢囊霉科对氮添加表现出明显的厌氮性有关，由于多样孢囊霉科可以促进细胞壁的溶解，因此施加氮肥降低了该科对土壤有机质的降解，导致其相对丰度降低［35］。此外，研究还发现，不同氮添加水平对AMF群落中不同科相对丰度的影响不相同，其中类球囊霉科（Paraglomeraceae）和球囊霉科（Glomeraceae）相对丰度变化不显著，前人研究表明类球囊霉科（Paraglomeraceae）是青藏高原高寒草甸地区AMF群落的组成核心，该科具有稳定的种群结构，说明AMF群落在不同环境条件都有一个保守的核心物种［36］；同时还有研究表明球囊霉科（Glomeraceae）是我国北方的常见真菌，且它的分布范围广泛，能够耐受较大幅度的生境变化，其生态幅宽，侵染能力强［37］，因此这两科相对丰度变化不明显。球囊霉科（Glomeraceae）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）、原囊霉科（Archaeosporaceae）、双型囊霉科（Ambisporaceae）相对丰度呈现先上升后下降的趋势，这可能是因为青藏高原高寒草甸土壤中植物和AMF生长均受氮限制，因此适量氮添加可以提高植物的生产力，从而将更多的光合产物分配给AMF，促进了AMF的增长。但是，当氮继续增加时，植物生长不再受氮限制，降低了对AMF的依赖性［38］，AMF得到的光合产物减少，导致丰度降低。再者，随着氮添加水平的提高，对光合产物需求上的较大差异导致不同的AMF类群对氮添加产生不同响应［39］，所以各科相对丰度产生了不同变化。

关于氮添加对AMF群落多样性的影响，在亚高山草地的一项研究发现氮添加并不改变AMF的多样性，但会显著改变AMF的群落结构［40］。本研究中，在N5和N10处理下，Chao1指数显著降低，说明AMF群落丰富度降低。Shannon，Pieloue，Simpson指数变化不显著，说明AMF群落多样性稳定，这可能与氮添加的年限有关，有研究认为，短期氮沉降试验对土壤AMF多样性没有显著性影响［41］。氮对AMF群落多样性的影响可能有以下几种机制，首先，低的土壤pH值利于菌丝密度较低的AMF生长繁殖［42］。其次，由于不同的AMF对于对土壤环境有偏好性，对养分添加的响应不同，也会导致物种之间优势种的更替，导致丰富度降低。PCoA分析表明，在N10和N15处理下，AMF的β多样性发生显著改变，说明群落结构发生了一定的变化，这与一项在荒漠草原的研究结果相近［43］。

3.3" 不同氮添加水平下丛枝菌根真菌的影响因素

AMF群落组成与结构与土壤化学成分密切相关。AMF群落结构与环境因子的RDA分析得出，土壤铵态氮，硝态氮，有机碳显著影响AMF群落组成，这与之前的研究基本相似［44］。这是因为在青藏高原高寒地区，植物养分受氮限制，氮肥的施入，使得土壤中硝态氮和铵态氮含量上升，这两种无机氮更容易被植物吸收，减少植物对AMF的依赖，造成AMF群落结构发生变化。AMF和土壤SOC相互影响，一方面AMF可以维持土壤团聚体的形成与稳定性，增加碳的固存；另一方面，SOC的增加可以提供AMF生存所需要的资源，促进AMF分枝，提高对植物的侵染能力［45］。此外，有研究认为磷含量与AMF有着密切的联系，一定范围内的有效磷会促进AMF的生长，而过高的有效磷含量会抑制其生长和发育，不利于菌根效应的发挥［46］，本研究中，虽然磷含量对于AMF群落整体没有显著相关性，但是明显影响了巨孢囊霉科（Gigasporaceae）的相对丰度。总的来说，仅关注某种养分元素对AMF群落的影响是片面的，应结合地上、地下生态系统及其养分循环和植物、土壤等多方面因素，综合评价AMF生长及其群落组成和多样性对不同氮添加的响应。

4" 结论

综上，随着氮添加水平增加，土壤全磷含量和pH值显著降低，土壤硝态氮含量显著上升。青藏高原高寒草甸土壤中的优势AMF科是类球囊霉科（Paraglomeraceae）。氮添加显著降低多样孢囊霉科（Diversisporaceae）的相对丰度，并显著改变了AMF群落的丰富度。冗余分析表明，土壤铵态氮，硝态氮和有机碳含量是影响AMF群落的关键因素。本试验探究了不同氮添加水平下AMF群落变化及驱动因子，以期预测全球大气氮沉降背景下青藏高原高寒草甸土壤AMF多样性的未来变化提供理论依据。

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（责任编辑" 刘婷婷）