入侵植物一年蓬基因组DNA提取方法优化

基金项目 安徽省自然科学基金面上项目“入侵植物一年蓬的谱系分化格局与适应性进化研究”（1908085MC58）；安徽省高等学校省级质量工程项目“《植物学》野外实习虚拟仿真实验教学”（2021xnfzxm062）；安庆师范大学校级质量工程项目（2022aqnujyxm45）。

作者简介 王仕文（2003—），男，安徽安庆人，从事生物入侵与生态安全研究。

通信作者 童跃伟（1987—），男，安徽芜湖人，博士，讲师，从事生物入侵与生态安全研究。

收稿日期 2024-03-07

摘要 一年蓬为菊科飞蓬属植物，是分布较广、危害较重的一种外来入侵杂草。为优选该植物基因组DNA的提取方法，本研究采取四因素三水平正交试验设计，对一年蓬基因组DNA的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取方法进行优化，并与常规的植物基因组试剂盒法进行对比。结果表明，一年蓬基因组DNA较优的提取方法为改良CTAB法，即一年蓬的干燥叶片经CTAB-free去除多糖，并加入β-巯基乙醇防止酚氧化，用氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因组DNA质量较高，微量分光光度计检测的A260/A280数值接近1.8～2.0，且凝胶电泳DNA条带清晰，无明显拖带。该方法为该植物的遗传多样性和入侵机制等研究提供参考。

关键词 菊科；一年蓬；DNA提取方法；改良CTAB法；正交试验

中图分类号 Q949.783.5；Q75"" 文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2024）13-0066-05

Optimization of DNA extraction methods from invasive plant Erigeron annuus

WANG Shiwen""" YANG Ziqiong""" WEI Shuya""" DING Tong""" GU Wanru""" CHEN Yubei""" QU Lili""" TONG Yuewei

（Research Center of Aquatic Organism Conservation and Water Ecosystem Restoration/

School of Life Science， Anqing Normal University， Anqing 246133， China）

Abstract Erigeron annuus， which belongs to the genus Suaeda of Asteraceae family， is one of the most widely distributed and seriously harmful alien invasive weeds. To select a better method for extracting genomic DNA of E. annuus， the CTAB method for extracting genomic DNA of E. annuus was optimized by orthogonal experiment with four factors and three levels， and compared with the common plant kit method. The results showed that the modified CTAB method was used to extract genomic DNA of E. annuus. This involved treating the dried leaves of E. annuus with CTAB-free to remove polysaccharides， adding β-mercaptoethanol to prevent phenol oxidation， and extracting with chloroform：isopentanol （24∶1） three times. The quality of the DNA extracted by the optimized scheme was good， with A260/A280 values measured by a microspectrophotometer close to 1.8 to 2.0， and the gel electrophoresis image band was clear without obvious drag. This method laid a foundation for studies on the genetic diversity and invasion mechanisms of E. annuus.

Keywords Asteraceae; Erigeron annuus; DNA extraction method; modified CTAB method; orthogonal test

生物入侵被认为是导致生态环境碎片化以及生物多样性丧失的关键因子之一[1]，可能会给地方生物多样性造成较大的危害，该问题现已演变为全球性的重大环境问题和经济问题[2]。菊科飞蓬属植物一年蓬（Erigeron annuus）广泛分布于野外次生演替群落中[3]。该植物是目前分布较广、危害较重的外来入侵杂草之一[4]。该物种种子量大[5]，种子具冠毛[6]以及生态幅较宽[7]，易在入侵地区大面积扩散蔓延；而且其化感作用会抑制周围植物的生长发芽[8]，在一定程度上影响区域生态系统的稳定性。目前，对于一年蓬的研究主要集中于其自身的化学成分分析[9]、化感作用[10]等方面，而对其分子生物学及入侵机制等方面的研究相对有限。鉴于此，运用分子生物学对一年蓬群体遗传多样性和遗传结构进行分析，探讨其种内谱系地理格局形成机制、系统发育关系以及入侵机制的研究十分必要，而高质量的一年蓬基因组DNA的获取尤为关键。

目前，关于植物基因组DNA的提取方法有很多，应用较多的有常规十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[11]和植物试剂盒法（DP-320）。常规CTAB法因不同植物材料在化学成分、组织结构等方面存在差别，提取效果往往差异较大[12-14]，在应用上有一定的局限性；植物试剂盒法可以快速、有效提取植物基因组DNA，无需酚、氯仿抽提，避免了试剂污染，但成本较高。基于此，为建立一种高效且经济的一年蓬基因组DNA提取方法，本研究对常规CTAB法进行改良，设计四因素三水平正交试验，并与植物试剂盒法进行对比，目的是筛选出该物种一年蓬基因组DNA的较优提取方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料" 试验所用一年蓬均采集自安庆师范大学校园内，均选取幼嫩叶片作为试验材料。将采集的植物样本清洗干净，使用变色硅胶对其进行快速干燥处理，并保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.1.2 试剂" 改良CTAB法所用试剂：Tris、EDTA、CTAB和琼脂糖（上海生工生物工程有限公司）；loading buffer、核酸染料、50×TAE缓冲液（北京索莱宝公司）；液氮、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇和无水乙醇等均为国产分析纯。

植物试剂盒法所用试剂：DP-320新型植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.1.3 仪器" 移液枪、电泳仪、凝胶成像仪、微量分光光度计、恒温水槽和水浴锅等。

1.2 DNA提取方法

1.2.1 改良CTAB法" 设置样品质量（A）、CTAB-free剂量（B）、β-巯基乙醇剂量（C）和水浴时间（D）的L9（34）正交试验，对比不同因素对DNA提取质量的影响。DNA提取步骤如下。

（1）根据表1提供的样品质量，取相应质量的样品至2 mL无菌离心管中，加入两颗直径5 mm的钢珠，在液氮中冷冻样品，随后快速研磨样品1 min。（2）加入相应剂量的预热CTAB-free溶液和β-巯基乙醇，置于65 °C恒温水浴锅中水浴，根据表1水浴相应时间，其间每隔10 min均匀摇晃离心管一次，水浴结束后12 000 r/min离心5 min，取上清液。（3）上清液加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿∶异戊醇体积比为24∶1。上下混匀成乳浊状，室温放置2～5 min，随后12 000 r/min离心5 min。（4）重复步骤（3）3次。（5）取上层水相至干净的离心管中，加入2倍体积的冰镇无水乙醇，置于-20 °C冰箱30 min以上，以沉淀DNA；然后10 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入500 μL 75%乙醇，洗涤1～2次，弃上清液，置于超净台晾干水分；加入100 μL无菌水溶解、混匀，保存于-20 °C备用。

1.2.2 植物试剂盒法" 使用前先在缓冲液LP3和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照标签说明。提取步骤如下。

（1）取新鲜植物组织100 mg或干组织20 mg，加入液氮充分研磨，加入400 μL缓冲液FGA和6 μL RNaseA（10 mg/mL），旋涡振荡1 min，室温放置10 min；加入130 μL缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液至干净离心管中。（2）上清液中加入1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前先检查是否已加入无水乙醇），立即充分混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀；将溶液和絮状沉淀一并加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12 000 r/min离心30 s，倒掉废液。（3）向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12 000 r/min离心30 s，倒掉废液。注意：如果吸附柱膜呈绿色，吸附柱CB3中加入500 μL无水乙醇，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液。（4）重复操作步骤（3）。（5）将吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温，以彻底晾干吸附材料中残余漂洗液。（6）将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50～200 μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5 min，12 000 r/min离心2 min，收集滤液至离心管中。

1.3 DNA产率和质量检测方法

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测" 用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的片段大小、降解情况。取2 μL DNA提取液，加3 μL无菌水、1 μL loading buffer混匀后滴入1%琼脂糖凝胶，100 V电泳30 min，在紫外凝胶成像仪上观察并记录。

1.3.2 分光光度计检测" 取2 μL样品DNA溶液，用微量分光光度计测定样品DNA的A260/A280值。根据分光光度计测定的吸光度（A）判断DNA的提取质量，A值在1.8～2.0，DNA的质量较佳；A值小于1.8，说明样品DNA中存在酚类或蛋白质污染；A值大于2.0则说明样品DNA中有RNA污染[15]。

2 结果与分析

2.1 CTAB提取方法的优化

设置样品质量（A）、CTAB-free剂量（B）、β-巯基乙醇剂量（C）和水浴时间（D）的L9（34）正交试验，对比不同因素对DNA提取质量的影响。由表2可看出，相较于处理7，处理9的DNA吸光度数值最低，为1.583。吸光度极差数据R显示，4个因素对DNA吸光度的影响顺序为Dgt;Agt;Cgt;B，其中样品质量、β-巯基乙醇剂量和水浴时间这3个因素对DNA的吸光度均影响较大。

由表3可知，处理7得到的DNA浓度最高，平均值为424.7 ng/μL；处理6的浓度最低，为104.7 ng/μL。说明样品量、β-巯基乙醇及水浴时间对DNA提取浓度有明显影响，极差数据R显示，4个因素对一年蓬DNA提取浓度的影响顺序为Agt;Dgt;Cgt;B。

综合来看，处理7得到的DNA浓度最高，平均值为424.7 ng/μL，吸光度平均值为1.766。因此，一年蓬叶片DNA浓度最佳的提取条件为处理7，即样品量0.03 g，CTABfree溶液700 μL，β-巯基乙醇50 μL，水浴时间30 min，在该条件下提取的一年蓬基因组DNA浓度最高，吸光度平均值接近1.8。4个影响因素中样品质量、β-巯基乙醇剂量和水浴时间对提取的DNA浓度和吸光度均有明显影响。

2.2 改良CTAB法与植物试剂盒法提取效果对比

改良CTAB法提取的DNA，在电泳时加样孔干净，无拖带降解现象，DNA浓度较高（图1A）；而植物试剂盒法提取的DNA谱带电泳时加样孔干净，无拖带现象，但对比改良CTAB法其DNA浓度不高（图1B）。

lt;G：＼农学通报＼2024-13期农学通-内文＼Image＼A1303-1.tifgt;[（A）][M 1 2 3 4][（B）][M 1 2 3 4][5 000][5 000]

（A）改良CTAB法；（B）植物试剂盒法；M为Maker；1～4为DNA样品。

图1 一年蓬基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

采用超微量分光光度计测定DNA的A260/A280比值，比较两种提取方法提取的DNA样品的纯度。结果表明，改良CTAB法提取的DNA的A260/A280平均比值为1.769，接近1.8～2.0范围，受酚类、蛋白质和RNA物质污染较少，DNA纯度较高（表4）；而植物试剂盒法提取的DNA的A260/A280平均比值为1.569，距1.8～2.0范围有一定差距，说明DNA样品可能被酚类或蛋白质等物质污染，其提取的DNA纯度较改良CTAB法低（表5）。

3 结论与讨论

针对一年蓬植物，在常规的CTAB提取方法基础上进行了改良：添加了β-巯基乙醇，以有效地抑制酚类物质的氧化，从而减少了DNA降解[16]；在样品研磨过程中采用液氮低温研磨，减少了DNA降解；样品研磨时使用无菌小钢珠，在充分研磨样品的同时避免了DNA污染[17]；为充分除去样品中的蛋白质和脂类物质，用氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提3次[18-19]。此外，对样品质量、CTAB-free溶液剂量、β-巯基乙醇剂量及水浴时间进行了定量试验，通过设计正交试验对比不同因素对DNA提取质量的影响，改良CTAB法提取的一年蓬叶片基因组DNA浓度和纯度较高，优于植物试剂盒法。后续可考虑水浴温度、抽提次数等因素，采用正交试验设计分析这些因素对一年蓬叶片基因组DNA提取效果的影响，对该方法进行进一步优化。改良CTAB法使用材料成本较低，相较于植物试剂盒法可以有效节约成本，获得纯度和浓度更高的一年蓬基因组DNA。

王军等[20]对山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）基因组DNA的提取方法，宋国立等[21]对棉花（Gossypium）基因组DNA的提取方法进行了与本研究类似的改良，均加入了β-巯基乙醇，增加了氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提次数，提取的DNA凝胶电泳检测加样孔清晰，条带无拖带，且A260/A280值在1.8～2.0内，即使用改良CTAB法均能提取到对应研究对象的高浓度、高质量的基因组DNA。

综上，本研究采取四因素三水平正交试验设计，对一年蓬基因组DNA的CTAB提取方法进行优化，并与常规的植物基因组试剂盒法进行对比。结果表明，一年蓬基因组DNA较优的提取方法为改良CTAB法，即一年蓬的干燥叶片经CTAB-free去除多糖，并加入β-巯基乙醇防止酚氧化，用氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因组DNA质量高，微量分光光度计检测A260/A280值接近1.8～2.0，且凝胶电泳检测DNA条带清晰无明显拖带。该改良CTAB法为获取高质量的一年蓬基因组DNA提供了方法，为一年蓬的遗传多样性和入侵机制等研究奠定了基础。

参考文献

[1] 杨力凤，杨楠，付海滨，等. 环境DNA技术在生物入侵研究中的应用进展[J]. 植物保护学报，2023，50（1）：1-10.

[2] PIMENTEL D. Environmental and economic costs associated with nonindigenousspecies in the United States[M]//Biological invasions. Boca Raton：CRC Press，2002：285-303.

[3] 王哲，田胜尼，张永梅，等. 巢湖派河口滩涂植物群落特征研究[J]. 生态环境学报，2022，31（9）：1823-1831.

[4] 王瑞，王印政，万方浩. 外来入侵植物一年蓬在中国的时空扩散动态及其潜在分布区预测[J]. 生态学杂志，2010，29（6）：1068-1074.

[5] 周巍，杨俊杰，王海燕. 南湾湖湿地外来入侵植物种多样性调查研究[J]. 信阳农林学院学报，2019，29（2）：79-82.

[6] 范建军，乙杨敏，朱珣之. 入侵杂草一年蓬研究进展[J]. 杂草学报，2020，38（2）：1-8.

[7] 张茹春，蒋红军，孟赫男，等. 石家庄市园林绿地外来入侵植物种类及分布特征[J]. 杂草学报，2023，41（1）：18-26.

[8] 方芳，茅玮，郭水良. 入侵杂草一年蓬的化感作用研究[J]. 植物研究，2005，25（4）：449-452.

[9] 宋楷，郑晓珂，张靖柯，等. 一年蓬的化学成分研究[J]. 中国药学杂志，2016，51（17）：1462-1466.

[10] 谭永钦，胡兵，熊程，等. 紫茎泽兰和一年蓬浸提液化感作用的对比研究[J]. 湖北农业科学，2011，50（11）：2250-2253.

[11] PAHLICH E，GERLITZ C. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemistry，1980，19：11-13.

[12] 吴晟昊，杨丽，向松竹，等. 珍稀濒危树种金钱槭的基因组DNA提取方法研究[J]. 安徽农业科学，2024，52（3）：91-94.

[13] 许源升，陈宏夏，田慧，等. 壮药白花蛇舌草不同部位总DNA提取方法的比较研究 [J]. 壮瑶药研究，2023（2）：150-153，386-387.

[14] 潘映秋，洪亮，卢启寰，等. 石斛基因组DNA提取方法比较研究[J]. 中国食物与营养，2023，29（7）：26-30.

[15] 占塔鹏，黄舒婷，乔柱，等. 山豆根基因组DNA高效提取方法的建立与优化[J]. 分子植物育种，2020，18（8）：2585-2590.

[16] 朱高倩，王丽，殷子喻，等. 含灯盏花中成药DNA提取及其分子鉴定[J]. 中国现代中药，2023，25（9）：1878-1886.

[17] 赵晓彤，梁文达，沈风娇，等. 微量苔藓样品DNA提取实验方案改良[J]. 河北师范大学学报（自然科学版），2023，47（5）：515-521.

[18] 黄永会，朱英，刘永翔. 适于植物愈伤组织DNA提取的改良CTAB法[J]. 农技服务，2014，31（9）：46-47.

[19] 单志，吴宏亮，李成磊，等. 改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究[J]. 广东农业科学，2011，38（8）：113-115.

[20] 王军，贺普超. 山葡萄基因组DNA提取及RAPD鉴定[J]. 果树科学，2000，17（2）：79-82.

[21] 宋国立，崔荣霞，王坤波，等. 改良CTAB法快速提取棉花DNA[J]. 棉花学报，1998，10（5）：50-52.

（责编：何 艳）