复方万年青胶囊神经保护作用成分的水提取工艺研究

高陆++王美慧++魏晓雨++曲佳乐++姜文月

【摘要】目的：确定具有神经保护作用新药的最佳水提取工艺参数。方法：采用L9（34）正交试验设计优选最佳工艺，以总皂苷和出膏率为综合评分指标，优选最佳水提取工艺，并对优选工艺进行验证。结果：最佳水提取工艺是10倍水，提取3次，每次提取1h。结论：优选后的水提取工艺稳定可靠，可为进一步开发利用该新药提供参考。

【关键词】神经保护作用新药；正交试验；综合评分

【中图分类号】R2842【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）19-0114-03

老年痴呆泛指发生在65岁以后的各类痴呆，包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和混合型痴呆等类型[1]。随着人口老龄化的加速，老年痴呆的患病率高、疾病负担严重，已成为一个全球性的公关卫生问题，其社会成本计划相当于癌症、心脏病和中风成本的总合[2-3]。老年痴呆给患者及家庭带来巨大的医疗、心理和情感压力，因此从天然药物中探索开发具有神经保护作用的新药势在必行。

复方万年青胶囊是由万年青、人参、黄芪等10味中药组成的纯中药抗癌药物，具有解毒化瘀、扶正固本的功效。用于肺癌、肝癌、胃癌化疗合并用药，具有减毒增效的作用。基于Drug-similar 概念的复方抗癌药新用途开发，通过连接网络数据库，将疾病、基因与药物利用基因表现数据进行串连，将药物处理细胞后的基因表现图谱与连接网络数据库的基因表现图谱进行比对，发现复方万年青胶囊具有神经保护作用。实验采用L9（34）正交试验设计，水提取工艺以总皂苷和出膏率为评分指标，考察料液比、提取时间、提取次数对工艺的影响，优化神经保护作用有效成分最佳提取工艺，为研究具有神经保护作用的新药工艺开发提供实验依据。

1仪器与材料

11仪器Ultra-6100型紫外可见分光光度仪（北京普源精电科技有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；SB-1200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；AB135-S电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

12材料人参皂苷Re（批号：110754-201324，中国食品药品检定研究院），半枝莲、黄芪、人参均由吉林天力泰药业有限公司提供，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2方法

21水提取正交试验设计复方中半枝莲、黄芪、人参的主要活性成分大多为水溶性物质，因此采用传统水煎煮法进行提取，采用L9（34）正交试验（表1）。

综合评价指标计算方法：（出膏率×03/最大值+总皂苷×07/最大值）×10。

22出膏率考察按处方量称取半枝莲、黄芪、人参药材，混合后加水浸泡1h，按照正交试验设计表分别进行提取。将所得提取液浓缩、干燥，称定干膏重量，计算水提取的干膏得率。

23总皂苷含量测定

231对照品溶液制备精密称取人参皂苷Re标准品1198mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1198mg/mL。

232供试品溶液制备精密称取所得各干浸膏粉末05g分别置于50mL锥形瓶中，精密加入甲醇30mL，超声处理20min，放置室温，过滤，减压蒸干甲醇，用15mL蒸馏水溶解，转移至分液漏斗中。 加乙醚萃取3次（20mL/10mL/5mL），弃去乙醚层。水层加入水饱和正丁醇萃取4次（30mL/20mL/15mL/10mL），合并正丁醇萃取液，用01mol/L的NaOH溶液洗正丁醇层2次，每次10mL，弃去NaOH层，减压回收正丁醇至干，用甲醇分次洗涤、转移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度线，即得供试品溶液。

233标准曲线的绘制精密量取人参皂苷Re标准品溶液0、40、80、120、160、200μL于比色管中，挥干溶剂，加入5%的香草醛醋酸溶液 02mL和高氯酸08mL，在 60℃条件下水浴加热 15min后，取出，并冷水浴至室温，精密加入5mL冰醋酸[4]，在544nm波长处测定吸光度，以人参皂苷Re标准溶液的浓度为横坐标，以测得的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程：Y=49562X-00321（R=09999），结果显示人参皂苷Re在48～240μg范围内与吸光度线性关系良好。

234测定方法精密量取供试品溶液02mL置具塞比色管中，水浴挥干溶剂，按上述标准曲线项下方法进行处理，并测定吸光度，计算，即得。

3结果

31正交试验结果分析由表2显示的试验统计结果可直观分析，极差RC>RA>RB，表明影响该组合物的提取因素主次顺序为：提取次数（C）>料液比（A） >提取时间（B），各因素不同水平的影响次序为：A3>A2>A1B3>B2>B1C3>C2>C1，因此从上诉实验数据分析其最佳提取工艺为A3B3C3，即加10倍量水，煎煮提取3次，每次2h。

表3所得综合评价指标方差分析结果显示，因素C的P<005，表明提取次数对提取效率具有显著性影响，料液比和提取时间的影响不显著，为降低成本、节能减排，故将提取时间确定为1h。因此，综合以上分析结果，最终确定的最佳工艺为A3B2C3，即10倍量水，煎煮提取3次，每次1h。

32验证试验按复方量称取药材5份，按正交试验所选择的工艺路线，即A3B2C3，即加水10倍量，提取3次，每次1h进行提取，计算干膏平均得率为1954%（n=5，RSD=136%），总皂苷含量为1168mg/g（n=5，RSD=102%）。

4讨论

复方万年青胶囊为多味药组成的复方，经细胞亲和-质谱联用技术筛选的结果表明，该组方中抗老年痴呆活性组分主要包括蒽醌类、黄酮类和皂苷类，细胞亲和-质谱联用技术筛选的结果将另行发表。黄芪中黄芪甲苷在神经系统保护作用中显示出重要的作用，黄芪甲苷可以增加周围神经的再生率，增强神经元轴突再生和重建[5]，且目前已经证实黄芪甲苷可以提高神经元的存活能力[6]；人参皂苷是人参的主要药理活性成分，它对中枢神经系统和外周神经系统都有作用[7]。半枝莲的主要成分为黄酮类等，水溶性较好，因此与黄芪、人参一并水提取，水提取路线中以总皂苷和出膏率为评价指标。

人参总皂苷是一类含有糖苷键的四环或五环三萜类化合物，测定目标是四环三萜或五环三萜，即皂苷元[8-9]。比色法测定人参总皂苷的定量原理：皂苷元中的C3和C12上的羟基与香草醛上的醛基发生反应，形成缩醛，成为新的共轭体系而显色，因此，人参总皂苷的定量测试应符合以下要求：a人参皂苷应完全水解成皂苷元；b人参皂苷元结构不被破坏；c皂苷元在一定的浓度范围与香草醛显色反应呈线性，且所水解下来的糖对测试影响较小。实验过程中，笔者尝试加入3%、5%、7%和10%的香草醛醋酸溶液，随着香草醛用量的增加，人参总皂苷的吸收有所增加，空白颜色也加深，但是整体净吸收呈稳定趋势，说明反应已达到饱和，本实验选择5%的香草醛醋酸溶液；实验中考察了加入高氯酸的用量，分别加入04、06、08、10、12mL高氯酸，其中加入04mL和06mL高氯酸时，吸光度较低，说明水解不完全，本实验选择加入08mL的高氯酸。

依据方差分析结果得知，因素A和因素B的P>005，表明料液比和提取时间影响不显著，黄芪、人参和半枝莲三味药材中半枝莲体积大、较吸水，为将药材充分浸泡，将料液比确定为10倍；另外为降低成本、节能减排，将提取时间确定为1h。因素C的P<005，表明提取次数对提取效率具有显著性影响，因此煎煮提取3次。综合以上分析结果，最终确定的最佳工艺为10倍量水，煎煮提取3次，每次1h；水提取的干膏平均得率为1954%，总皂苷含量为1168mg/g。根据实验室优化的提取条件进行中试生产，结果表明本工艺条件适于产品的工业化，在此条件下，工艺条件温度，产品质量稳定、均一，表明此工艺条件具有可行性和适用性。

参考文献

[1] 李铮. 老年痴呆相关概念辨析 [J]. 中华护理杂志，2011，46 （10）： 1045.

[2] World Health Organization. Dementia： a public health priority [R]. Geneva： WHO，2012.

[3] Luengo-Femandez R，Leal J， Gray A. Dementia 2010： the prevalence， economic cost and research funding compared with other major diseases[R]. Booklet， Alzheimers Research Trust， 2010.

[4] 万玉华，戴洁，黄春静，等. 紫外分光光度法测定参须中的人参总皂苷的含量 [J]. 中国中医药现代远程教育，2012，10 （24）： 146-147.

[5] 张志国. 黄芪甲苷对帕金森病神经元的保护作用及其机制研究 [D]. 西安：第四军医大学，2012.

[6] 刘德丽，包华音，刘杨. 近5年黄芪化学成分及药理作用研究进展[J].食品与药品，2014，16（1）： 68-70.

[7] 刘红梅，李瑞雪，杨学军，等. 人参皂苷的神经保护作用和机制及其在神经变性疾病中的应用[J].大连医科大学学报，2009，31（5）： 595-598.

[8] 杨文志，于淑莲，娄子恒，等. 论人参总皂苷的科学定量方法[J].人参研究，2007，2： 7-10.

[9] 孙慕白，金竺. 红参炮制工艺及质量研究[J].长春中医药大学学报，2014，30（4）： 611-613.

（编辑：程鹏飞）