基于网络药理学探讨“姜黄-虎杖”药对干预足细胞病变的作用机制

赵凯 程小红 卢芬萍 王悦彤 李娜梅 董诚 袁二磊

*基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFC1709404）；科技部国家重点研发计划中医药现代化研究项目（2018YFC1704201）

第一作者简介：赵凯（1991-），男，硕士研究生，研究方向：慢性肾脏病基础与临床研究。

△通信作者：袁二磊，E-mail：18709189120@163.com

摘要：目的  应用网络药理学预测“姜黄-虎杖”药对干预足细胞病变的可能作用靶点与机制，为临床应用及实验研究提供思路。方法  借助中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP），检索姜黄、虎杖的化学成分及其对应靶点蛋白，运用Cytoscape3.2.1生物信息分析软件绘制“疾病-成分-靶点”网络图。在OMIM、DrugBank、GeneCards数据库中检索足细胞病变相关靶点，利用Venny2.1.0获取与“姜黄-虎杖”作用靶点的交集基因。应用STRING数据库及Cytoscape3.2.1软件的“CytoNCA”插件构建交集基因蛋白质-蛋白质相互作用关系（PPI）网络图并进行拓扑学分析，获取核心预测靶点。借助DAVID数据库对交集基因进行（GO）和（KEGG）通路富集。结果  获得活性成分11种，其中姜黄3种、虎杖8种，主要包括豆甾醇（Stigmasterol）、木犀草素（luteolin）、囊毒碱（Physovenine）等。PPI网络图共包含节点33个、连线333条，AKT1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、TNF（肿瘤坏死因子-α）等基因处于核心位置。GO分析共获得生物信息条目1127个（P<0.05），KEGG通路富集条目244个（P<0.05），主要涉及AGE-RAGE、PI3K-Akt、NF-κB、AMPK等信号通路等。结论  姜黄-虎杖药对可能通过参与细胞凋亡、氧化反应等生物过程，调控PI3K-Akt、NF-κB、AMPK等信号通路，从而发挥对足细胞病变的干预作用。

关键词：姜黄；虎杖；足细胞病变；网络药理学

中图分类号：R285.5    文献标志码：A    文章编号：1007-2349（2024）06-0060-09

足细胞是一种高度特化、没有增殖潜能的内脏上皮细胞，由足突、初级突起、胞体构成，胞体通过足突贴覆在肾小球毛细血管基底膜外，与肾小球基底膜以及有孔内皮细胞共同组成肾小球的滤过屏障［1］。而免疫性损伤如狼疮性肾炎，血流动力学损伤如肾单位减少、足细胞机械牵拉，代谢因素如高血糖、高血脂，基因突变等都会导致足细胞结构完整性破坏及细胞代谢失调，引起足细胞足突融合，进一步从肾小球基底膜脱离，肾小球滤过屏障结构和功能损害，产生蛋白尿，甚至肾小球硬化等疾病［2］。近年来随着肾脏穿刺活检术技术的成熟和肾脏损伤分子生物学研究的深入，肾小球足细胞病变在肾脏损伤中的重要作用多次被研究者提及，该病的防治越发受到肾脏病专业领域的学者的关注。笔者在跟随程小红主任医师学习期间，发现姜黄、虎杖的联合应用在有关足细胞病变的肾脏病治疗中具有良好的疗效。鉴于此，本研究运用网络药理学技术初步探讨“姜黄-虎杖”药对干预足细胞病变的主要化学成分、作用靶点及相关信号通路，为后期基础研究与临床用药的开展提供借鉴。

1  资料与方法

1.1  “姜黄-虎杖”药物活性成分及对应靶点收集  借助数据库中药系统药理学技术平台（TCMSP）（https：//old.tcmspw-e.com/tcmsp.php），设置条件为口服生物利用度（OB）≥30％、类药性指数（DL）≥0.18［3］。输入关键词“姜黄、虎杖”，筛选药物化学成分、对应靶蛋白。并在UniProtKB数据库（https：//www.uniprot.org/）中将检索条件设置为“Organism：Homosapiens”，查询潜在靶点蛋白的对应基因。

1.2  疾病靶点基因的筛选  以“podocyte disease”“podocytopathy”“Podocyte lesion”等足细胞病变的相关疾病为关键词，分别利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、DrugBank数据库（https：//www.drugbank.com/）、在OMIM数据库（https：//www.omim.org/）进行检索，得到各个数据库中足细胞疾病靶点，去掉重复靶点并取并集，得到足细胞疾病靶点数据集。

1.3  蛋白质-蛋白质（PPI）网络构建  将筛选得出的姜黄、虎杖活性成分对应靶点基因与足细胞病变所对应基因上传至Venny2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）中绘制韦恩图，取得疾病药物交集基因。将结果导入STRING数据库（https：//string-db.org）中，获取PPI网络图，利用Cytoscape3.2.1软件的“CytoNCA”插件进行拓扑学分析，根据拓扑参数值进一步筛选网络图中核心靶点［4］。

1.4  GO分析和KEGG信号通路富集  取姜黄-虎杖”与足细胞病变的交集基因，在DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）中进行GO和KEGG生物学过程富集分析。以物种“Homo sapiens（人）”，标识符“（Official gene symbol）”为条件［3］，筛选P<0.05的富集条目，并以P值从小到大进行排序。获取前20位富集条目导入OmicShareTools数据库（https：//www.omicshare.com/tools/），以条形图、气泡图形式展示富集分析结果。

2  结果

2.1  “姜黄-虎杖”药对化学成分筛选结果  在TCMSP数据库中共获得活性化学成分11种，其中虎杖8种、姜黄3种，设置条件为OB≥30％、DL≥0.18，活性化学成分基本信息详见表1。

2.2  “疾病-成分-靶点”网络分析  “姜黄-虎杖”药对与足细胞病变的关键靶点图见图1。共包含节点123个、连线242条。其中，中药节点2个、活性成分节点11个、靶点蛋白节点110个。其中豆甾醇、木犀草素、囊毒碱、beta-谷甾醇、槲皮素等对应的靶点较多，可能是姜黄-虎杖作用于足细胞病变的核心活性成分。

2.3  “姜黄-虎杖”药物靶点与疾病靶点交集结果  本次研究得出姜黄作用靶点28个、虎杖作用靶点98个、足细胞病变相关基因1552个。导入Venny2.1.0在线作图（见图2）后，获取变交集基因44个，其中3个为柴胡与黄芩共同作用靶点（PTGS2、PTGS1、PIK3CG）。

2.4  PPI网络的构建与分析结果  通过STRING数据库在线构建姜黄-虎杖干预足细胞病变的PPI网络图，结果以TSV格式导出并输入Cytoscape3.7.1软件中可视化，绘制出一个由33个节点组成包含333条边的蛋白质互作网络图，同时根据Degree值对蛋白从大到小进行排列，Degree值为节点中心度，数值

越大代表节点之间关系更密切。本研究以Degree值≥30为筛选条件，共获得910个关键靶点，由此推测AKT1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-6（白介素-6）、CASP3（胱天蛋白酶3）、MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）、EGFR（表皮生长因子受体）、JUN（核内原癌基因）、TP53（肿瘤蛋白P53）可能为姜黄-虎杖干预足细胞病变的关键靶蛋白。

2.5  GO基因分析与KEGG通路富集结果  通过GO基因分析得到1127个条目（P<0.05），其中生物过程（BP）条目1033个、细胞组成（CC）条目38个、分子功能（MF）条目56个，见图3。生物过程主要以无机物反应（response to inorganic substance）、细胞凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、类固醇激素反应（response to steroid hormone）、氧化反应（response to oxygenlevels）等为主要富集条目，见图4；细胞组成主要涉及膜筏（membrane rafts）、转录调节蛋白（transcription regulator complex）、膜侧（side of membrane）、受体复合物（receptor complex）等，见图5；分子功能主要涉及激酶结合（kinase binding）、蛋白质同源二聚化活性（protein homodimerization activity）、磷酸酶结合（phosphatase binding）等，见图6。KEGG富集获得244个（P<0.05）信号通路，显著富集的前20条通路详见图7。结果显示姜黄-虎杖干预足细胞病变的可能与HepatitisB（乙肝病毒感染通路）、AGE-RAGEsignaling pathway indiabetic complications（糖尿病并发症中的AGE-RAGE通路）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Aktsignalingpathway）、HepatitisC（丙肝病毒感染通路）、NF-κB信号通路（NF-kappaB signaling pathway）、癌症通路（Pathways in cancer）、疟疾（Malaria）、AMPK信号通路（AMPK signaling pathway）等通路有关。表明姜黄-虎杖的活性靶点可通过调控多个通路协同发挥治疗作用。

3  讨论

2002年Pollak首次提出“足细胞病”这一概念，即以足细胞病变为显著特点的肾小球疾病，机体代谢紊乱、血流动力学改变、免疫复合物形成、基因突变、中毒以及感染等皆可诱发，病理学一般表现为肾小球足细胞数量减少、肾小球基质成分改变、基底膜的增厚、足突融合等，临床出现大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿等症状［5］。根据病因可将足细胞病分为3类，原发性、获得性和遗传性。原发性足通常以微小病变、局灶节段性肾小球硬化以及膜性肾病的表现形式而发病；而获得性足细胞病多为自身免疫性、感染相关性、药物相关性、肿瘤相关性、肾移植相关性膜性肾病等；遗传性足细胞病有家族性肾病综合征、遗传性FSGS等［6-7］。

中医古籍中并无“足细胞病变”的名称，但根据其临床特点，一般归于中医“水肿”、“尿浊”、“肾劳”等范畴。水肿多由体内肺、脾、肾三脏功能失调所致，肺为华盖，在上不能制约水源，脾脏无力运化水湿，肾脏在下不能固摄精气，精微物质流失，气虚无法通调水道，从而导致疾病的发生。程小红主任医师从医40余年，在中西医结合治疗肾脏病方面具有丰富的临床经验，认为其病因病机主要为本虚标实，正虚为本，湿邪为标，兼杂瘀血。正虚为本，正如《景岳全书》［8］曾论证水肿道：“凡欲辨水气之异者，在欲辨其阴阳耳……若病在水分，则多为阴证……阳衰则气不化，而精即为水……水不能化，因气之虚……此水肿之病，所以多属阳虚也。瘀血为患，《血证论》［9］中言：“水湿泛溢，阻滞气机……，血行缓慢而成瘀……”。程小红主任医师在肾脏病理学领域具有较高的造诣，将显微镜下的病理改变视为中医望诊的延伸，认为肾脏足细胞病变属“肾络微型癥瘕”，治疗上注重活血化瘀散结。临床治疗尤其善使用姜黄、虎杖药对，姜黄可行气、破血、除风热，虎杖能利湿、清热、活血化瘀，二者配伍具有清热利湿，活血行气之功效。现代药理学研究发现，姜黄含有姜黄素类、挥发油类、黄酮类、酚酸类等成分，并且具有较好的抗肿瘤、抗病毒、抗炎、调血脂等作用［10］。虎杖含有蒽醌类、二苯乙烯类、萜类等化学成分，具有抗炎、免疫调节、抗氧化、改善糖脂代谢、心血管、肝、肾保护等作用［11］。

本研究通过“疾病-成分-靶点”网络模型的预测分析得出为豆甾醇、木犀草素、囊毒碱、beta-谷甾醇、槲皮素等作用靶点较多，推测为“姜黄-虎杖”干预足细胞病变的主要活性成分。相关药理学研究发现，豆甾醇具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性，可通过调节雌激素、内分泌抵抗、甲状腺激素等信号通路上MAPK3、PRKACA等核心靶点的表达，调控细胞因子水平，从而发挥抗炎作用［12-13］。槲皮素属于黄酮类化合物，广泛存在于自然界中，可通过抑制p38MAPK、NF-κB信号通路抑制炎症因子的表达，从而发挥抗炎、改善氧化应激和免疫调节作用，进一步减轻肾小球系膜增生和基底膜增厚，发挥保护肾脏功能的目的。靳英丽等［14］研究发现槲皮素可通过增强nephrin和podocin蛋白在足细胞内的表达保护肾脏。张兆洲等［15］研究发现槲皮素可通过阻断转化生长因β1信号转导通路中的分子，抑制转化生长因子P1诱导的足细胞向间充质细胞转分化，达到维持肾小球滤过屏障的完整性的作用。相关研究表明β-谷甾醇可通过降低因组胺释放引起的小鼠毛细管通透性增加，抑制NF-κB信号通路，活化IL-10，降低PEG2、缓激肽、组胺等炎症介质活性，缓解炎症反应［16-17］。木犀草素属于黄酮化合物，存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎、神经保护和抗过敏的特性。木犀草素中含有的酚羟基具有较强的还原性，同时它还可抑制环氧化酶２的产生，从而抑制氧化反应［18］。木犀草素同时能够调节IL-6、IL-10等炎症因子表达抑制炎症反应［19］。

信号通路作为细胞外分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路，在整个生理、病理过程中发挥着重要作用［3］。本次研究KEGG通路富集结果显示PI3K-Akt、癌症、AMPK、NF-κB等可能是“姜黄-虎杖”药对干预足细胞病变的关键信号通路。PPI拓扑学分析结果显示，AKT1、VEGFA、TNF-α、IL-6、CASP3、MAPK1等靶点处于网络核心位置。可能为姜黄-虎杖干预足细胞病变的关键靶蛋白。PI3K/Akt信号通路作为一个复杂的信号转导系统，参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程。有研究表明足细胞损伤中肌动蛋白细胞骨架的紊乱与PI3K有关。PI3K/AKT 信号通路是mTOR 的上游调控通路，NR1 被认为具有足细胞保护作用，而PI3K/AKT/mTOR 信号通路的活化参与 NR1 介导细胞保护作用［18］。在足细胞病变中，由CD2相关蛋白（CD2AP）介导PI3K募集于质膜上，并刺激足细胞中PI3K依赖的Akt信号转导，最终引起足细胞结构、功能完整性损伤，甚至凋亡［20］。NF-κB信号通路可调控参与炎症反应的基因表达，是足细胞损伤的重要靶点。TLR4作为NF-κB上游转录因子，在肾小球炎症过程也发挥着关键作用。TNF-α和IL-6是TLR4/NF-κB信号通路激活的产物，而高糖刺激可促进TLR4高表达，激活的TLR4在肾脏中进一步诱导足细胞中NF-κB的活化，而促进炎症因子TNF-α、IL-6的释放，加重足细胞的炎症损伤［21-23］。AMPK信号通路是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是足细胞关键的代谢调节器和能量传感器，由AMP／ATP比值决定其活性，当出现ATP消耗增加、AMP浓度升高的情况时，比如缺血缺氧、低血糖、应激、和运动等，可调控AMPK活化，促进足细胞营养吸收并增强其分解代谢［24］。相关研究表明通过调控AMPK通路改善足细胞能量代谢，抑制氧化应激，减少足细胞凋亡，促进足细胞肌动蛋白重塑等方式减轻糖尿病肾病足细胞损伤，进一步延缓病情进展［25］。肾小管上皮细胞及内皮细胞可分泌TNF-α，可介导炎性因子的分泌及聚集，进一步加重炎肾脏损伤［26］。苑佳奇等［27］研究发现随着TNF-α作用浓度及作用时间的增加，足细胞受损严重，相关蛋白表达量明显降低。血管内皮生长因子（VEGF）是一 种多向性分子，其中在骨髓的造血细胞、发育肾组织的神经纤维中都有表达，并且多种生物效应的发挥也会通过 VEGF和它的异性受体相互结合。肾小球中的VEGF可自行分泌后继续作用于足细胞，且在足细胞上有特异性的结合位点，对足细胞进行增殖和分化扮演非常重要的作用［28］。以上研究均间接的验证了本研究预测的生物过程和信号通路的可行性。

综上所述，姜黄-虎杖药对的关键活性成分为豆甾醇、木犀草素、囊毒碱、beta-谷甾醇、槲皮素等，可能通过PI3K-Akt、癌症、AMPK、NF-κB等信号通路作用于AKT1、VEGFA、TNF-α、IL-6、CASP3、MAPK1等核心靶点发挥稳定足细胞病变功能。本研究运用网络药理学方法充分体现了中医药多成分、多靶点、多通路的特性，与中医药治疗整体观的基本思路相符合，为后续的临床和实验研究提供了客观依据。但此次局限于在线数据库的生物信息分析层面，仍需进一步实验研究进行验证。

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（收稿日期：2023-08-07）