单细胞转录组测序技术在伤口愈合中的研究进展

王嘉厅 李冬青 吴信峰

[摘要]伤口愈合是皮肤受伤或感染后修复皮肤屏障的一个复杂生物學过程。伤口愈合不良会导致机体的功能障碍，严重影响患者的生活质量，同时显著增加了患者的经济负担。随着高通量测序技术的发展和成熟，单细胞转录组测序技术因其能精细划分细胞亚群、评估细胞异质性、追踪细胞谱系、识别稀有细胞等独特优势已被广泛应用于生物医学领域中。本文主要综述单细胞转录组测序技术在伤口愈合中的研究进展，旨在为伤口愈合的基础和临床研究提供参考。

[关键词]单细胞转录组测序；伤口愈合；急性伤口；慢性伤口；病理性瘢痕

[中图分类号]R619+.6    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）05-0175-05

Advances in Single-cell Transcriptome Sequencing Technology in Wound Healing

WANG Jiating1， LI Dongqing 1，2， WU Xinfeng1

（ 1.Hospital for Skin Diseases， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Nanjing 210042， Jiangsu， China; 2.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology of Dermatology and Venereal Diseases， Institute of Dermatology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Nanjing 210042， Jiangsu， China ）

Abstract： Wound healing is a complex biological process of repairing the skin barrier after a skin injury or infection. Poor wound healing leads to dysfunction of the organism， which seriously affects the quality of life of patients and significantly increases their economic burden. With the development and maturation of high-throughput sequencing technology， single-cell transcriptome sequencing technology has been widely used in biomedical fields due to its unique advantages such as its ability to finely delineate cell subpopulations， assess cellular heterogeneity， track cell lineage， and identify rare cells. In this paper， we summarize the research progress of single-cell transcriptome sequencing technology in wound healing， aiming to provide a reference for basic and clinical research on wound healing.

Key words： single-cell transcriptome sequencing; wound healing; acute wounds; chronic wounds; pathological scarring

皮肤损伤后的伤口愈合涉及皮肤不同层次的各种细胞成分和细胞外基质之间的结合和交流。在正常的生理条件下，表皮屏障功能的修复是非常有效的，但真皮深层的修复则相对较差，会导致瘢痕的形成，丧失了原有的组织结构和功能。当正常的皮肤修复程序出现问题时，有两个主要的结果：皮肤溃疡（慢性伤口）或瘢痕组织过度增生（病理性瘢痕）[1]。伤口愈合过程极其复杂，其分子机制尚不明确，且易受各种系统因素如高龄、肥胖、糖尿病和血管性疾病等影响。近年来，单细胞转录组测序技术已成为生命科学领域中的新宠儿，与传统的bulk转录组测序获得混合细胞群的平均基因表达相比，其可在单个细胞的转录组学水平上进行高通量测序，为人类更加深入地研究和理解疾病的发生发展提供了全新的视角。本文主要阐述单细胞转录组测序在伤口愈合（包括急性伤口、慢性伤口、病理性瘢痕）中的研究进展。

1  急性伤口与单细胞转录组测序

在正常皮肤中，皮肤稳态和屏障功能是通过常驻的角质形成细胞、树突状细胞、T细胞、肥大细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和微生物组之间的相互作用建立的。当皮肤屏障被破坏时，伤口执行一套循序渐进的自我修复过程，包括炎症期、增殖期和重塑期，每个阶段都被一系列的细胞因子和介质激活，最终愈合修复皮肤屏障。

1.1 角质形成细胞：角质形成细胞作为表皮主要细胞类型，参与急性伤口愈合的各个阶段。在炎症期，角质形成细胞能释放各种促炎因子和抗菌肽，进一步趋化免疫细胞扩大炎症反应，同时辅助免疫细胞清除伤口中病原体；在增殖期和重塑期，角质形成细胞增殖、迁移、分化来形成表皮屏障[2]。

Haensel D等[3]剖析了小鼠急性伤口和正常健康皮肤中基底细胞构成、异质性和细胞动力学，发现两者均存在四种基底细胞亚群：Early-response （ER）、Growth-arrested （GA）、Col17a1Hi三种非增殖亚群以及MKi67+增殖亚群，前三者分别高表达Fos、Cdkn1a、Col17a1/Trp63；拟时序分析表明基底细胞分化轨迹是从Col17a1Hi亚群开始的，首先分化成ER亚群，进而分化为MKi67+增殖亚群或分化为GA亚群，最终向着棘层分化。Siriwach R等[4]发现溶血磷脂酸能通过RHO/ROCK-SRF和ERK信号通路诱导小鼠伤口中基底细胞分化为THBS1+迁移型角质形成细胞，促进伤口愈合。Li D等[5]解析了人类急性伤口和正常健康皮肤中角质形成细胞的异质性，可分为四类亚群：KRT10+棘层细胞、S100A7+颗粒层细胞、IFITIM1+和IGFBP3+基底细胞，急性伤口信号可诱导前两者的比例升高。

此外，表皮中有1%～10%的基底细胞属于表皮干细胞，按解剖部位可分為毛囊间表皮干细胞和毛囊皮脂腺单位中的干细胞。毛囊间表皮干细胞通过增殖、终末分化从而实现表皮自我更新，维持表皮的稳态；来自毛囊的干细胞有助于伤口的再上皮化。Wang S等[6]研究发现人类新生儿表皮中存在四种处于不同空间位置的毛囊间表皮干细胞亚群，分别高表达PTTG1、RRM2、ASS1、KRT6A/GJB2，WNT靶基因和表观遗传修饰因子UHRF1和HELLS以及原癌基因PTTG1对表皮稳态至关重要。Joost S等[7]发现皮肤伤口信号会激活Lgr5+毛囊隆突干细胞的毛囊间表皮特性，下调隆突相关基因，来快速适应伤口微环境。

1.2 成纤维细胞：在增殖期和重塑期，各种细胞因子刺激成纤维细胞增殖和迁移形成伤口肉芽组织，分泌细胞外基质，最终逐渐纤维化形成瘢痕。成纤维细胞也能释放各种生长因子促进角质形成细胞增殖，部分成纤维细胞亚群可以被激活形成肌成纤维细胞促进伤口收缩[1]。

Driskell RR等[8]通过对小鼠进行系谱追踪，发现小鼠背部真皮成纤维细胞按解剖部位和标记基因可分为四个亚群：CD26+/Sca1-乳头层成纤维细胞、Dlk1+/Sca1-网状层成纤维细胞、Sca1+/Dlk1+和Sca1+/Dlk1-原脂肪成纤维细胞。Guerrero-Juarez CF等[9]发现创伤会诱发小鼠伤口中成纤维细胞的高度异质性，确定了一种罕见的具有髓系特征的成纤维细胞亚群可以促进脂肪的再生。Tabib T等[10]首次通过单细胞转录组测序识别了人类真皮中两种主要的成纤维细胞亚群：第一种表达SFRP2和DPP4/CD26，可能参与细胞外基质沉积或定向的经典作用，第二种表达FMO1、LSP1和CXCL12，可能在CXCR4+免疫细胞的滞留中发挥作用。Philippeos C等[11]通过空间转录组和单细胞转录组测序分析的结合，将人类真皮成纤维细胞划分为：CD90+/CD39+/CD26-细胞，其特点是表达特定的胶原，定位在真皮上部；CD90+/CD36+细胞，位于真皮下部，代表前脂肪细胞；其余三种位于整个网状真皮：CD90+/CD39-/RGS5+细胞，对应周细胞，以及CD90+/CD39+/CD26+和CD90+/CD39-/RGS5-细胞，它们是尚未定性的成纤维细胞亚群。由此可见，人类真皮成纤维细胞的单细胞转录组测序数据集的结果之间明显缺乏可重复性，这可能归因于供体部位和特征不同或样本处理的取样异质性[12]。Ascensión AM等[13]对已发表的单细胞数据集进行重新分析，识别了三大类成纤维细胞和十种亚型，其标记基因在不同研究中具有显著一致性。还有研究表明，成纤维细胞类型的转变及其分泌的炎症因子IL6/TNF的比例是小鼠体外重编程的变异性和影响体内伤口愈合速率的关键因素[14]。

1.3 免疫细胞：在伤口早期，中性粒细胞主要负责促进炎症反应和杀灭伤口部位入侵的病原体；M1促炎型巨噬细胞需要清除凋亡的中性粒细胞，而M2抗炎型巨噬细胞发挥调节和修复功能，促进伤口闭合，导致后期瘢痕形成[2，15]。

Liu Y等[16]发现人脐带间充质干细胞来源的外泌体能诱导中性粒细胞和巨噬细胞的异质性，改变两者的功能表型，伤口中存在BCL2A1B+增殖型中性粒细胞以及RETNLG+和SLC2A3+迁移型中性粒细胞；外泌体还能诱导巨噬细胞向抗炎表型分化，加速伤口愈合。Wee WKJ等[17]发现Angptl4能激活干扰素激活基因202B的表达，从而调节单核细胞向巨噬细胞分化，协调中性粒细胞和炎症的清除；Angptl4缺失会延长中性粒细胞的存在时间，减少单核细胞衍生的巨噬细胞，延长伤口愈合的炎症阶段。

单细胞转录组测序揭示了皮肤稳态和急性伤口微环境中各类表皮细胞亚群及其异质性，识别了某些特定的表皮细胞亚群在急性伤口愈合中发挥的关键作用，了解各类细胞亚群在伤口愈合中的作用有助于研发新的治疗策略。通过抑制有害的细胞亚群的作用，如抑制这些亚群特异的信号通路或使用单克隆抗体介导的消融；或者在体外扩增有益的细胞亚群有望成为治疗的研究热点。例如：在小鼠的伤口愈合过程中，实验性地耗尽肌成纤维细胞可以减少纤维化的程度[18]。乳头层成纤维细胞在构建组织工程皮肤替代品方面似乎比其他成纤维细胞更有效[19]。

2  慢性伤口与单细胞转录组测序

慢性伤口是指因某些因素如高龄、糖尿病、血管性疾病等，炎症细胞未能清除伤口中残存的微生物污染，伤口停留在炎症晚期，炎症细胞与驻留的微生物形成一个稳定的平衡状态，伤口不能愈合，而是形成一个持续的溃疡，常见的慢性伤口类型有静脉性溃疡、糖尿病足溃疡及压力性溃疡等。

2.1 角质形成细胞：慢性伤口中角质形成细胞分泌的各种基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）会导致再上皮化缺陷，伤口边缘的角质形成细胞的细胞周期蛋白相关基因表达上调，反映了其可能处于增殖激活的状态。角质形成细胞中某些miRNA的调节功能受损也会导致皮肤伤口修复延迟。Li D等[5]首次通过SMART-Seq2对人类压力性溃疡（Pressure ulcer，PU）进行全长单细胞转录测序分析，并与正常急性伤口和匹配的健康皮肤相比较，发现压力性溃疡中IFN-γ能刺激MHC-II+角质形成细胞亚群比例升高，抑制T细胞的激活，这可能与PU中的免疫失调相关，预示着PU的预后不良。

2.2 成纤维细胞：慢性伤口不能愈合的一个重要因素是肉芽组织有缺陷，部分原因是MMPs表达升高和成纤维细胞浸润不良。此外，不愈合的慢性溃疡伤口中成纤维细胞表现出衰老表型，迁移能力减弱，对生长因子信号无反应[1]。

Theocharidis G等[20]通过比较愈合和不愈合的糖尿病足溃疡（Diabetic foot ulcer，DFU）单细胞转录组图谱，发现愈合的DFU中富集表达MMP1、MMP3、MMP11、HIF1A、CHI3L1和TNFAIP6的独特成纤维细胞亚群，功能实验表明过表达CHI3L1可以改变成纤维细胞行为，表现为黏附能力增强和迁移能力降低，表明此类成纤维细胞亚群可能黏附在细胞外基质上并通过分泌相关分子介导愈合。与不愈合的DFU相比，愈合的DFU中成纤维细胞亚群表型主要为胶原生成和促纤维化[21]。此外，愈合的DFU中存在一类富含COL7A1的乳头层成纤维细胞亚群，VII型胶原蛋白是基底膜的主要成分，是真表皮交界处的中心结构，在伤口愈合中起着关键作用[22]。

2.3 免疫细胞：慢性伤口通常会受到感染，并表现出持续的异常炎症反应，TNF-α和ROS等促炎因子表达升高，IL-10和TGF-β等促愈合因子表达下降，中性粒细胞和M1型巨噬细胞长期存在导致伤口炎症持续，肥大细胞和CD8+T细胞增强了这一过程。其他炎症T细胞亚型（如 Th1、Th17和Th22）的水平也会升高。

单细胞转录组和空间转录组结果表明，愈合的DFU中有更高的M1型巨噬细胞、幼稚和中央记忆T细胞丰度，而不愈合的DFU中存在更多的NK和NKT细胞，IFN-γ、VEGF和sVCAM-1等表达增加与DFU愈合有关[20，22]。Ma J等[23]对链霉素诱导的糖尿病小鼠模型伤口边缘内的CD45+免疫细胞进行了单细胞转录组测序研究，揭示了慢性伤口模型中巨噬细胞的异质性，为研究糖尿病慢性伤口的免疫相关机制提供了重要参考。

慢性伤口的共同特征是反复发生细菌感染、血管生成减少、表皮上皮化受损和活性氧（ROS）过多，最终导致持续的炎症和伤口难以愈合[15]。上述研究探索了与慢性伤口愈合相关的各种细胞因子、细胞亚群，靶向此类细胞因子和细胞亚群有利于实现慢性伤口的精准医疗。更多慢性伤口如静脉性溃疡的单细胞转录组测序图谱仍有待进一步的研究。

3  病理性瘢痕与单细胞转录组测序

病理性瘢痕是一种由异常的伤口愈合引起的纤维增生性皮肤病，是机体对损伤修复的过度反应，表现为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度沉积，包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。

3.1 成纤维细胞：伤口愈合炎症期延长会导致成纤维细胞活性增加，并增强TGF-β1、TGF-β2、IGF1和其他细胞因子的分泌，TGF-β1促使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞具有收缩表型，其特点是过度分泌细胞外基质成分，是形成病理性瘢痕的主要因素。

Vorstandlechner V等[24-25]发现了一组丝氨酸蛋白酶（二肽基肽酶DPP4和尿激酶PLAU）能够调节TGF-β1介导的肌成纤维细胞分化和细胞外基质过度产生，应用DPP4和PLAU抑制剂进行局部治疗能够抑制增生性瘢痕的形成。Griffin MF等[26]發现JUN在全身或特异性过表达能促进细胞外基质沉积，诱导小鼠增生性瘢痕形成，此过程由CD36来调控，用抑制剂阻断CD36或在小鼠模型上敲除CD36可以抵消JUN介导的纤维化功效。在瘢痕疙瘩中，成纤维细胞可分为四种亚群：乳头层分泌型、网状层分泌型、间充质型和促炎症型[27-28]。与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中CD90+/CD266+/CD9-间充质型成纤维细胞亚群的比例明显升高，可能通过POSTN促进瘢痕疙瘩中胶原合成[27]。Liu X等[29]确定了可能参与瘢痕疙瘩纤维生成的关键转录因子如TWIST1、FOXO3和SMAD3，TWIST1抑制剂harmine可以明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的纤维化。Xia Y等[30]研究发现曲安奈德联合5-氟尿嘧啶可以阻断成纤维细胞向促纤维化亚型分化，并可能通过抑制细胞间通讯中FGF信号传导途径诱导瘢痕疙瘩萎缩，但同时刺激了部分成纤维细胞自我复制和多向分化的潜能，这可能是瘢痕疙瘩复发的细胞来源。

3.2 施万细胞：细胞作为外周神经系统的神经胶质细胞，在周围神经损伤后会进行转录重编程，包括向未成熟的状态去分化和获得特异性修复功能，确保神经的正常发育和完整性。已有相关研究表明，施万细胞不仅有助于神经再生，还能促进真皮伤口愈合[31]。Direder M等[32]发现瘢痕疙瘩中施万细胞的比例明显升高，其中主要是高表达NES、IGFBP3、IGFBP5、TFGBI、TNFAIP6的瘢痕疙瘩型施万细胞亚群，表型为促纤维化，能够促进细胞外基质合成和影响巨噬细胞M2型极化。该团队后续研究发现瘢痕疙瘩旁的正常皮肤中施万细胞比例也显著升高，这可能与瘢痕疙瘩的高复发率相关；并通过标记基因确定了各类施万细胞亚群[33]。Xia Y等[30]发现曲安奈德联合5-氟尿嘧啶皮损内注射治疗瘢痕疙瘩，能减少瘢痕疙瘩型施万细胞亚群比例，并诱导施万细胞向衰老、凋亡方向分化。Gong T等[34]发现施万细胞与细胞外基质相关细胞群包括成纤维细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞之间存在着由SEMA3C信号通路和MK/PTN基因家族介导的相互作用，这种细胞群之间的相互作用可以促进细胞增殖和迁移，从而促进耳部瘢痕疙瘩的形成。

3.3 免疫细胞：越来越多的证据表明免疫细胞在瘢痕疙瘩中失调。与正常皮肤相比，瘢痕疙瘩皮损中有大量的T细胞、B细胞和肥大细胞浸润，高活性的巨噬细胞还可以促进Foxp3+调节性T细胞的分化，瘢痕疙瘩中免疫微环境失调尚未完全阐明。

Xu H等[35]发现NKG2A/CD94复合物特异性的上调可能是瘢痕疙瘩皮损中CD8+T细胞明显减少的原因，NKG2A/CD94复合物与可溶性人类白细胞抗原-E（sHLA-E）的高血清水平有关，且sHLA-E具有较高的敏感性和特异性，与瘢痕疙瘩的高复发率高度相关，因此，sHLA-E可有效地作为评估瘢痕疙瘩形成风险的诊断指标和皮内治疗临床结果的预后指标。Feng C等[36]研究了瘢痕疙瘩的免疫细胞图谱，结果表明瘢痕疙瘩中可能存在以巨噬细胞为中心的通讯调控网络，这有助于进一步理解瘢痕疙瘩的免疫学特征。

目前，已知皮肤纤维化与机械张力增加、特定生长因子（TGF-β1）的上调、特定成纤维细胞亚群产生过度的细胞外基质相关，但由于缺乏理想的病理性瘢痕动物模型，对介导病理性瘢痕的关键机制阐明受到了极大的阻碍。上述研究阐明了病理性瘢痕形成过程中的关键调节因子、信号通路和细胞亚群，描述了其相关表型，部分解释了病理性瘢痕高复发率等相关临床特征，靶向这些信号分子及其下游通路可以有效抑制病理性瘢痕的形成。但是小鼠的瘢痕模型并不能完全反映人类病理性瘢痕的纤维化状态。因此，在大型动物（猪）上测试病理性瘢痕治疗的有效性能更好地反映人病理性瘢痕的病理状态。

4  小结和展望

单细胞转录组测序通过对异质组织中单个细胞的转录组情况进行分析，在剖析复杂的异质细胞群方面非常有效，可以识别特定细胞类型内单个细胞表达水平的极端差异性，阐明特定细胞表达水平对整体表型的独特作用，并预测细胞配体-受体的相互作用，使人类更加深入地了解细胞的功能和疾病的病理生理学。但单细胞转录组测序也存在一定的局限性，如某些组织类型单细胞悬液制备困难、价格昂贵、细胞的空间信息丢失、技术噪音、某些非编码RNA仍难以检测等。其中部分不足可以通过与空间转录组测序结合互补，空间转录组学是一种较新的方法，能够对单个组织切片的转录组进行可视化和定量，保留了空间分子信息。将单细胞转录组与空间转录组测序相结合，有望为转录动态和基因调控机制提供新的见解。除转录组外，单细胞技术的发展在基因组、表观遗传、蛋白组等方面也取得了许多进展，单细胞多组学策略的应用能够对同一细胞的多种分子模式进行联合分析，极大地改善了我们对人类疾病的基本认识。在伤口愈合研究方面，人类急性伤口的单细胞数据尚未有相关研究发表，是研究的一个空白和未来值得探索的一个方向；虽然人类慢性创面已有相关的研究，但不同慢性创面差异极大，机制也不同，仍缺乏对不同慢性创面的单细胞基因表达的横向比較。

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[收稿日期]2023-06-11

本文引用格式：王嘉廳，李冬青，吴信峰.单细胞转录组测序技术在伤口愈合中的研究进展[J].中国美容医学，2024，33（5）：175-179.