针刀对肌性斜颈模型兔胸锁乳突肌中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2蛋白表达的影响

高国莉

河北医科大学第三医院，河北 石家庄 050051

肌性斜颈（congenital muscular torticollis，CMT）以一侧胸锁乳突肌间质纤维化及挛缩为主，导致患儿头颈部向患侧偏斜，下颌部转向健侧，患儿出现头颈部和下颌部向患侧不能转动或活动受限，是小儿常见疾患之一［1-2］。随着年龄增长，若不及时治疗，CMT儿童病情逐渐加重，出现颅面部不对称，严重者可出现斜头畸形及脊柱侧凸等症状，手法干预较困难，需要进行手术治疗［3-5］。目前CMT的临床治疗手段包括超声短波、手术及中医推拿按摩、针灸、针刀治疗。研究发现，针刀较推拿按摩能够明显缩短胸锁乳突肌肿块直径，并且肿块缩小程度明显大于推拿按摩［6］。研究表明，针刀可以对病变组织起到剥离粘连、松解挛缩、疏通堵塞，镇痛减压、促进局部微循环、调节免疫等作用，但是针刀的具体作用机制尚未明确。骨骼肌出现萎缩，提示肌纤维中的蛋白含量减少［7］，其中钙蛋白酶1（calpain-1）是ATP-泛素-蛋白酶体途径的上游，可确保肌联蛋白和伴肌动蛋白降解［8］。分化抗原决定簇45（CD45）是一种特异性受体，定位于T细胞细胞膜上，能特异识别组织相容性复合体呈递的抗原，两者结合激活T细胞，促进其分化、发育［9］。基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）与骨骼肌损伤后的修复和再生阶段有关［10］，而基质金属蛋白酶抑制因子2（matrix metalloproteinase-2，TIMP-2）是其重要的内源性调节因子，能够抑制MMPs的活性。本研究观察针刀与按摩对肌性斜颈模型兔胸锁乳突肌中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级新西兰兔48只，雌雄各24只，周龄为4～5周，体质量2.0～3.0 kg，购于北京实验动物研究中心，实验动物许可证号：SCXK（京）2018-0016。实验期间实验动物可自由饮水、进食及活动。本研究经河北医科大学第三医院伦理委员会审批（伦理审批号：2019-007）。

1.2 试剂及仪器 TUNEL试剂盒（德国罗氏公司40308ES50）；一抗calpain-1为兔多克隆抗体（美国abcam公司，批号：ab239930），一抗CD45为兔多克隆抗体（美国abcam公司，批号：ab40763）；一抗MMP-2为兔多克隆抗体（美国abcam公司，批号：ab213910），一抗TIMP-2为兔多克隆抗体（美国abcam公司，批号：ab180630）；二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）。汉章牌一次性针刀（0.40 mm×40 mm，北京华夏针刀医疗器械厂），无水酒精（国药集团化学试剂有限公司，批号：100092680）。FS/FAS5030石蜡切片机（德国LETIZ公司），全自动免疫组化染色机［徕卡显微系统（上海）贸易有限公司BOND-MAX］，Nikon eclipse50i光学显微镜（日本Nikon株式会社）。

1.3 实验方法

1.3.1 造模方法 参照文献［11］研究方法，选取右侧胸锁乳突肌中段注射部位常规消毒，用注射器吸入无水酒精后做肌肉注射，回抽无回血后缓慢注射，注射量按照1 mL/kg标准，15天后形成肌性斜颈动物模型。造模成功表现：模型组镜下可以非常明显观察到成片的肌细胞变性、坏死，炎性细胞浸润，SCM间质增生以及大量组织纤维化，模型组周围组织可见明显、大量阳性反应产物（α-SMA），阳性反应区呈弥漫性分布。

1.3.2 分组及干预 由SPSS软件产生两组随机数，将实验动物性别分为两组，再按照体质量升序排列将其随机分为正常组、模型组、针刀组、按摩组，每组各12只，雌雄各半。正常组：不做任何处理，常规饲养。模型组：造模成功后不做任何干预治疗，常规饲养。针刀组：造模成功后动物固定在治疗台上，对其颈部进行触诊，每次选取斜方肌起点、胸锁乳突肌乳突附着点及局部硬结或条索状物2～3个点定为针刀进针部位，记号笔标记，常规备皮、消毒，然后刺入针刀，于进针部位先行纵向疏通，再辅以横向剥离等手法操作，出针并按压3 min止血，每周1次，4次为1个疗程，疗程间休息2天，共治疗2个疗程。按摩组：造模成功后，采用拿揉法，以单手拇指指腹与食、中二指指腹相对，拿持住模型兔的胸锁乳突肌作吸定基出之上的回旋与提起揉动，边拿揉边沿胸锁乳突肌纤维方向从上至下缓缓移动，在移动中若发现指下有结块，则定点揉动1 min。频率为120次/min，每次操作5 min，每天操作1次，10次为1个疗程，疗程间休息2天，共治疗5个疗程。

1.3.3 标本采集 治疗结束后，沿实验动物耳背静脉注入空气致死，沿右侧胸锁乳突肌外缘作纵切口，暴露出完整的胸锁乳突肌，取胸锁乳突肌中段组织约0.5 cm，进行HE染色和免疫组化检测。

1.4 观察指标

1.4.1 效应观察 治疗后观察各组实验动物颈部活动情况，以及是否出现斜颈、头颈不对称表现，观察胸锁乳突肌色泽、粗细、血管等。

1.4.2 calpain-1、CD45、TIMP-2及MMP-2表达 采用HE染色和免疫组织化学染色检测各组兔胸锁乳突肌中段肌肉组织中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2的表达情况。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以表示，采用完全随机设计资料方差分析，方差齐则组间两两比较采用LSD-t检验，方差不齐则组间两两比较采用Dunnett's T3检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 效应观察 与正常组比较，其余各组动物明显出现颈部活动受限、斜颈、头颈不对称症状，治疗结束后，针刀组和按摩组实验动物颈部活动受限明显改善，头颈无明显不对称。见表1。

表1 各组兔治疗结束后胸锁乳突肌形态学表现

2.2 机制探讨

2.2.1 calpain-1表达 正常组中肌性斜颈细胞表达较少；模型组中表达量多，呈强阳性表达，镜下表现为多量胶原纤维包绕呈萎缩或变性；针刀组和按摩组表达较模型组明显减少，呈弱阳性表达。与正常组比较，模型组、按摩组上调（P＜0.01）；与模型组比较，针刀组、按摩组下调（P＜0.01）；与针刀组比较，按摩组上调（P＜0.01）。见表2、图1。

图1 各组兔calpain-1表达免疫组化图（HE，×100）

表2 各组兔肌性斜颈细胞中calpain-1、CD45、MMP-2及TlMP-2表达量比较（）%

表2 各组兔肌性斜颈细胞中calpain-1、CD45、MMP-2及TlMP-2表达量比较（）%

注：与正常组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；与针刀组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

TIMP-2 7.21±2.72 17.21±3.84**6.07±2.11##10.75±2.93*##△△24.806＜0.001组别正常组模型组针刀组按摩组兔数12 12 12 12 CD45 5.6±3.1 15.6±2.3**6.2±1.4##10.4±1.8**##△△53.525＜0.001 calpain-1 10.4±5.3 47.9±14.6**11.3±8.2##20.4±10.7**##△△42.233＜0.01 F P MMP-2 6.83±2.44 2.65±1.34**6.44±2.27##4.57±1.80#△9.043＜0.001

2.2.2 CD45免疫表达 CD45阳性表达为细胞膜有黄棕色颗粒。在正常组及针刀组中表现较少，而在模型组中大量表达。与正常组比较，模型组、按摩组上调（P＜0.01）；与模型组比较，针刀组、按摩组下调（P＜0.01）；与针刀组比较，按摩组上调（P＜0.01）。见表2、图2。

图2 各组兔CD45表达免疫组化图（HE，×100）

2.2.3 MMP-2免疫表达 MMP-2的表达多在细胞的胞质，表现为棕黄色或者棕褐色颗粒。模型组及针刀组中表现较多，模型组表现较少。与正常组比较，模型组下调（P＜0.01），与模型组比较，针刀组、按摩组上调（P＜0.05）；与针刀组比较，按摩组下调（P＜0.05）。见表2、图3。

图3 各组兔MMP-2表达免疫组化图（HE，×100）

2.2.4 TIMP-2免疫表达 TIMP-2的表达多在细胞的胞质，表现为棕黄色或者棕褐色颗粒。与正常组比较，模型组、按摩组上调（P＜0.01），与模型组比较，针刀组、按摩组下调（P＜0.01）；与针刀组比较，按摩组上调（P＜0.01）。见表2、图4。

图4 各组兔TIMP-2表达免疫组化图（HE，×100）

3 讨论

CMT是因一侧胸锁乳突肌（sternocleidomastoid muscle，SCM）因不同原因出现间质纤维化，最终出现肌肉挛缩，导致头颈部向患侧一方偏斜，易造成患侧面部与健侧不对称，患侧面部偏小，同时限制头颈部转向患侧一方。胸锁乳突肌出现此种变化不仅仅是简单纤维化的结果，是动态变化过程［7］。

骨骼肌出现萎缩提示肌肉体积较正常变小，肌纤维缩小，肌纤维中的蛋白含量减少［8-9］。其中肌内肌球蛋白、肌冻蛋白含量均减少。以上两种蛋白与肌纤维收缩功能有着密切关系［10］。与钙依赖的蛋白酶途径和ATP-泛素-蛋白酶体途径相关，而钙蛋白酶途径是ATP-泛素-蛋白酶体途径的上游，是确保肌联蛋白和伴肌动蛋白降解［11］。本研究结果表明，模型组中，calpain-1在肌性斜颈肌纤维中表达多量，呈强阳性表达，calpain-1为多量胶原纤维包绕呈萎缩或变性。在按摩组和针刀组，calpain-1在肌性斜颈肌纤维中表达较模型组明显减少，呈弱阳性表达。针刀组calpain-1表达水平较按摩组和模型组下降。

肌性斜颈病理特点显示胶原沉积在间质其中，且在肌细胞周边沉积多量成纤维细胞，两者共同作用导致肌纤维化改变，在肌细胞中混杂大量成纤维细胞［10］。在颈部患侧群肌肉中存在CD45。CD45阳性表达为细胞膜有黄棕色颗粒。本研究结果显示：针刀组CD45表达水平低于按摩组和模型组。

检测MMP-2在模型组中强阳性表达较正常组、针刀组、按摩组明显减少。MMP2主要水解的胶原物有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅸ型胶原及明胶（胶原降解后的产物），降解非胶原的细胞外基质有纤维连接蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖连接蛋白、多功能蛋白聚糖、弹力蛋白及骨结合素。研究表明，MMP2与骨骼肌损伤后的修复和再生阶段有关，在运动48 h和120 h这个阶段，运动针刺组MMP2的蛋白表达高于运动组，也说明运动针刺可以提高MMP2的含量［11］。针刀组中MMP-2的表达水平高于模型组和按摩组。本研究结果表明，针刀组中病变组织，肌细胞萎缩，MMP-2表达增加，TIMP-2表达下降，提示纤维组织减少，而肌肉组织有所增加。

CMT的主要发病机制为分娩时一侧胸锁乳突肌受产道挤压或产钳助产牵拉，间质纤维化，椎周软组织的急慢性损伤引起无菌性炎症，以及组织间的疤痕、粘连及挛缩，刺激、卡压穿行其间的血管、神经，同时粘连、挛缩的椎周软组织可牵拉其附着的椎骨发生力平衡失调，最终出现肌肉挛缩，导致肌性斜颈。拿揉按摩法可使细胞蛋白分解，促进组织修复，加速病变产物的吸收，使肌挛缩得以改善。两种方法治疗CMT，但是针刀疗法作用更为直接，具有更好的临床疗效。

综上所述，针刀治疗肌性斜颈可改善局部肌肉挛缩情况，能促进肌肉组织增加，能改善预后。其作用机制可能与减少calpain-1、CD45、TIMP-2表达，增加MMP-2表达有关。