雷公藤药蜡对胶原诱导关节炎小鼠模型关节炎症和骨侵蚀的影响*

彭柳莹，冯小可，钱晨

1 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023； 2 南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、渐进性、反复发作，涉及多关节的炎症性自身免疫疾病，其病理特征为滑膜炎，可反复发作，破坏关节软骨及骨质，最终导致关节畸形及功能障碍［1］，主要症状是全身关节游走性红肿、疼痛，并伴有轻、中度不规则发热［2］。RA患者的关节软骨及骨质破坏，即骨侵蚀的发生是由于破骨细胞的过度活化，造成成骨细胞的骨形成作用与破骨细胞的骨吸收作用失衡导致的。RA的临床常用药主要有非甾体抗炎药、生物制剂、镇痛药、抗风湿药及激素等，但均有胃部不适、肝损伤、肾毒性、影响内分泌系统等较为严重的不良反应［3］。现代研究表明，雷公藤具有免疫调节、解热镇痛、抗炎杀菌及抗肿瘤的作用，也是目前治疗RA广泛认可的单味中药［4］，但其毒性作用又与剂量成正比。如何对其减毒增效，使其具有更广阔的临床应用空间，是一直以来的研究重点。本研究以胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠为研究对象，观察雷公藤药蜡对关节炎小鼠关节炎症和骨侵蚀的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级DBA/1J雄性小鼠32只，体质量（20±5）g，购自上海斯莱克实验动物中心，实验动物合格证号：0356440。饲养条件：动物实验房保持室温21～23 ℃，相对湿度45%～65%，光照时间8∶00～20∶00，自由饮水及进食。所有研究均遵循实验动物护理指南的原则，并经南京医科大学动物实验伦理审查委员会批准（审批号：IACUC-1803012）。

1.2 药物及试剂 中药雷公藤购自广西中医药大学第一附属医院中药房（江阴天江药业有限公司）。雷公藤药蜡制备及方法：中药雷公藤打成细粉，与水以一定比例调匀，制药泥备用。

牛Ⅱ型胶原CⅡ（Thermo Fisher Scientific，批号：20021）；完全弗氏佐剂CFA、不完全弗氏佐剂IFA（Thermo Fisher Scientific，批号：F5881）；小鼠MIP-2 ELISA Kit（Abcam，批号：ab204517）；逆转录试剂盒（Qia-gen，批号：205111）；引物由美国Invitrogen公司合成。

1.3 实验仪器 E8O8酶联免疫检测仪（美国BIO-TEK Instruments公司）；TSJ-QX型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-A型病理组织包埋冷冻台、PHY Ⅲ病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）；ABI Prism 7900HT型PCR仪、实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）SYBR Green Mixture及384孔反应板（美国ABI公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 造模及分组 CIA小鼠模型制备：1）初次免疫。牛Ⅱ型胶原溶于0.05 M冰醋酸中，浓度4 mg/mL，4 ℃搅拌过夜。次日，取牛Ⅱ型胶原与等体积完全弗氏佐剂置于冰上乳化。混匀，使用1 mL进口螺旋注射器吸取。距小鼠尾根部1.5～2 cm处的尾巴的皮下注射，100 μL/mouse（150 μg/mouse，牛Ⅱ型胶原终浓度1.5 μg/uL）。注意避开静脉。2）加强免疫。初次免疫后第21天：牛Ⅱ型胶原溶于0.05 M冰醋酸中，浓度3 mg/mL，置于4 ℃冰箱搅拌过夜；牛Ⅱ型胶原与等体积不完全弗氏佐剂冰上乳化，混匀，小鼠尾根部1.5～2 cm处的尾巴的皮下注射，50 μL/mouse（75 μg/mouse，牛Ⅱ型胶原终浓度1.5 μg/μL）。如发现小鼠关节发红、肿胀，甚至出现关节强直、活动障碍，则表明造模成功。将24只DBA/1J雄性小鼠随机分为3组，每组8只，分别为正常组、CIA组、雷公藤药蜡CIA组。除正常组外，其余各组采用牛Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠模型。

1.4.2 给药方法 正常组、CIA组不给药，雷公藤药蜡CIA组在第2次免疫开始行雷公藤药蜡治疗，每天1次，每次30 min，连续3周。中药雷公藤打成细粉，以1∶5的比例与水调匀，制药泥备用。治疗时将小鼠固定于木板上，雷公藤药泥涂抹于四肢关节，石蜡加热，在石蜡未凝前敷于药泥上。

1.5 观察指标

1.5.1 急性皮肤刺激实验 另取8周龄SPF级DBA/1J雄性小鼠8只，以脱毛膏对称性地涂抹于小鼠脊柱两侧，片刻后用干净的纱布轻轻擦拭脱落的鼠毛，并以温水清洗背部脱毛区的皮肤，避免脱毛膏过多的残留，第2天于脱毛区左侧及小鼠四肢左侧关节行雷公藤药蜡，对应脱毛区右侧及小鼠四肢右侧关节行普通蜡疗，每日2次，连续5天，于除去中药及蜡残留后1、6、24 h观察小鼠皮肤的变化并评分。评分标准见表1。

表1 急性皮肤刺激实验的评分标准

1.5.2 小鼠一般情况 每天观察各组小鼠饮食、活动及毛发改变情况。

1.5.3 关节炎评分 小鼠足爪及踝关节肿胀度行关节炎评分。0分：无红肿；1分：足小趾关节红肿；2分：趾关节、足跖均红肿；3分：踝关节以下均红肿；4分：包括踝关节全部红肿。

1.5.4 HE染色组织病理学观察 将取下的CIA小鼠双侧踝关节，剔除关节周围肌肉皮毛及软组织，并对标本进行脱钙、脱水、包埋、切片，依照HE染色步骤进行染色，在光学显微镜下观察踝及足趾关节间隙、关节周围炎症、滑膜增生、炎性细胞浸润情况、血管翳形成及软骨下骨质破坏程度。

1.5.5 关节组织病理学评分 0分：没有组织病理学改变；1分：轻微局灶性浸润；2分：中度浸润；3分：严重炎症浸润，但无血管翳形成或软骨损伤；4分：非常严重的浸润，形成血管翳和（或）软骨、骨侵蚀。

1.6 统计学方法 数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以表示，采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性皮肤刺激实验 除去雷公藤药蜡及普通蜡疗后，小鼠给药背部皮肤及四肢关节均出现了发红、肤温升高，但无肿胀、红斑，持续时间5～15 min；在除去中药及蜡残留后1、6、24 h后，小鼠给药处均未出现水肿、红斑、皮疹、溃烂等，普通蜡疗及雷公藤药蜡对小鼠皮肤无刺激性，而5～15 min的皮肤发红现象为蜡疗温度引起的局部皮肤毛细血管扩张，属正常现象。见表2。

表2 小鼠不同时间点急性皮肤刺激评分比较

2.2 一般情况评估 实验前小鼠均活泼好动，毛色正常，睡眠尚可。加强免疫（免疫第21天）开始，CIA组及雷公藤药蜡CIA组小鼠逐渐出现关节肿胀，部分小鼠体质量增加不明显或稍见下降、近尾根部稍见脱毛、毛色稍暗淡，活动及饮食减少，正常组小鼠活动、饮食及毛色未见明显变化。初次免疫开始到免疫后第7周，正常组体质量平稳，而CIA组和雷公藤药蜡CAI组小鼠在免疫第5周开始体质量略有下降，其中雷公藤药蜡CAI组下降稍小于CIA组，但是与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组小鼠不同时间点体质量变化折线图

2.3 小鼠足爪及踝关节关节炎评分 CIA组和雷公藤药蜡CIA组均在初次免疫第28天关节炎评分开始增高，28～31天逐渐增高，32天达到最高，但是CIA组小鼠较雷公藤药蜡CIA组增高明显迅速，且前者之后10天关节炎评分仍保持较高水平，而雷公藤药蜡CIA组关节炎评分较CIA组降低明显（P＜0.01）。见图2。

图2 各组小鼠不同时间点足爪及踝关节关节炎评分折线图

2.4 组织病理学表现 正常组小鼠关节及其关节间隙正常，关节软骨无明显破坏，滑膜无明显增生，未见血管翳形成和骨质破坏。CIA组关节间隙明显变窄，关节明显破坏，滑膜组织增生，关节周围大量炎症细胞浸润。雷公藤药蜡CIA组关节间隙稍见狭窄，关节破坏较CIA组减少，滑膜增生不明显，关节周围少量炎性细胞浸润。见图3。

图3 各组小鼠关节病理学表现（HE，×200）

2.5 关节组织病理学评分 CIA组组织病理学评分明显高于雷公藤药蜡CIA组（P＜0.0001）。见图4。

图4 各组小鼠关节组织病理学评分

3 讨论

RA是以滑膜增生、多种炎症细胞浸润，骨与软骨破坏为主要病理特征的自身免疫系统疾病［5］。RA临床属于“痹证”“尪痹”的范畴。《素问·痹论篇》指出：“所谓痹者，各以其时，重感风寒湿之气也。”“风、寒、湿三气杂至，合而为痹。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹也。”又可因感邪季节、患病部位和临床表现而分，如《素问·痹论篇》曰：“以冬遇此者为骨痹，以春遇此者为筋痹，以夏遇此者为脉痹，以至阴遇此者为肌痹，以秋遇此者为皮痹。”痹证病因病机可分虚实，虚者由于肝肾亏虚，气血不足，筋骨食养，实者多因风寒湿热毒等邪侵袭，导致气血壅塞不通，关节、经脉、肌肉疼痛肿胀、麻木重着，久之毒邪入骨，痰瘀交结，造成关节畸形。

雷公藤又称断肠草、山砒霜、南蛇藤等，其性味苦、辛、凉，有大毒，归肝、肾经，具有祛风除湿、清热解毒、通络止痛、活血化瘀、消肿散结、杀虫止血等功效［6］。研究表明，雷公藤对缓解患者疼痛、改善患者生活质量、延缓病情进展等有重要作用［7］。雷公藤能够广泛地抑制趋化因子、前炎症细胞因子、炎症介质和血管内皮生长因子等炎性细胞因子，并能调节T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞［8］，还能抑制外周血单核细胞产生IgM、IgRF［9］。所以，无论是雷公藤单药或是其提取物制剂，均有良好的抗炎、镇痛［10-11］作用，常用于治疗RA［12］、银屑病关节炎［13］等，也因其具有等抗肿瘤［14］、免疫调节［15］等药理作用，临床上也用于治疗其他免疫性疾病（如：系统性红斑狼疮［16］）、肾炎（如：肾病综合征［17］、糖尿病肾病［18］、紫癜性肾炎［19］、狼疮性肾炎［20］）、肿瘤［21-22］及皮肤病［23］等。但是雷公藤中化学成分复杂，分离出的生物碱、二萜类、三萜类及苷类物质均有一定的毒性，二萜类毒性主要针对心、肝、骨髓、胃肠系统、生殖系统［24］，生物碱毒性主要损害肝脏及生殖系统［25］。所以对其减毒增效，使其具有更广阔的临床应用范围，是一直以来的研究重点。

《本草纲目》载：“用蜡二斤，于罗中熔，捏作一兜鍪，势可合脑大小，搭头至额，其病立止也。于破伤风湿、暴风身冷、脚上冻疮……均有奇效。”清代徐大椿说：“汤药不足尽病……用膏药贴之，闭塞其气，使药性从毛孔而入其腠理，通经活络，或提而出之，或攻而散之，较服药尤为有力。”所以对于风寒湿邪侵袭或气血运行不畅、经络闭阻不通一类病症的治疗效果尤佳。正如《理瀹骈文》所言：“切于皮肤，彻于肉里，摄入吸气，融入渗液。”

现代研究表明，中药蜡疗通过药物透皮、穴位刺激、温热效应、机械压缩等作用可使机体组织局部毛细血管扩张、促进血液循环、加快新陈代谢、缓解肌肉痉挛、减轻炎症反应，而石蜡的可塑性和黏滞性能对接触区域产生机械压迫并加强温热效果，使药物及热效应能更好地渗透入组织，并具有松解粘连、软化疤痕的作用。

本研究通过CIA观察中药雷公藤药蜡对关节炎小鼠关节炎症及骨侵蚀的影响发现，雷公藤药蜡CIA组关节炎评分较CIA组降低明显；HE染色提示与CIA小鼠踝关节相比，雷公藤药蜡CIA组关节间隙稍见狭窄，关节破坏较CIA组减少，滑膜增生不明显，但关节周围仍有少量炎性细胞浸润。关节组织病理学评分雷公藤药蜡CIA组组织病理学评分明显低于CIA组，且在实验过程中，急性皮肤刺激及一般情况评估均为正常。本研究提示，雷公藤药蜡能够减少滑膜组织的增生和炎性细胞的浸润，缓解关节的肿胀程度，减少骨质的破坏。雷公藤性烈，其药物渗透能力强，雷公藤药蜡通过雷公藤加蜡疗的协同作用直接针对病变关节，可通过“内属脏腑，外络肢节，沟通表里，贯穿上下”的经络穴位理论、药物透皮作用及石蜡自身的叠加作用达到良好的治疗效果。同时，该疗法也避免了口服给药造成的消化道系统、生殖系统等急慢性中毒反应。可见，雷公藤药蜡不失为一种简单、安全、有效的治疗RA的方法，也为临床应用提供了实验研究基出。但是，RA的发生包括外邪和内虚两端因素的影响，所以中医对RA的治疗不拘于一种药物或一种治疗，更有待于根据辨证论治开展复方治疗及外治联合治疗，以便更好地发挥中医在治疗RA中的优势，使患者病情早日得到缓解。