藏红花素通过PI3K/Akt/GSK-3β通路诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究*

赵宁，夏利敏，宋涛

邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例超过150万，并且仍以年度约2%的速度在增长，严重威胁着女性的生命健康。目前，手术切除并辅助放化疗是临床治疗乳腺癌的首选治疗方案，但化疗药物毒副作用广泛且易产生耐药性［1-2］。中医药因其整体调理、标本兼治、毒副作用小的优点，在肿瘤治疗方面得到了广泛的关注与认可。藏红花素为我国传统中药藏红花的主要活性成分，属于水溶性类胡萝卜素化合物，具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性［3-4］。近年来药理学研究发现，藏红花素具有抗肿瘤活性，能够诱导细胞凋亡，延缓胃癌、胰腺癌、卵巢癌的进展［5-7］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/ glycogen synthase kinase-3β，PI3K/Akt/GSK-3β）信号通路在细胞凋亡过程中发挥着重要的调控作用，并且有研究报道，藏红花素能够通过调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，促进人食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞凋亡［8-9］。本研究于2019年6月至2020年4月通过体外培养人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞，并给予藏红花素进行干预，探讨藏红花素对人乳腺癌细胞凋亡及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 细胞 人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院上海细胞库（货号：SCSP-575、SCSP-531）。

1.2 药物与试剂 藏红花素（美国Sigma公司，批号：E180924b）；LY294002、胰蛋白酶（美国Sigma公司，批号：L9762、190106）；DMEM培养基（高糖）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：190509、190611）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（美国AMRESCO公司，批号：1324B37）；Annexin V-FITC试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20190417）；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶9（cysteine aspartic proteases-9，Caspase-9）、激活型半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteine aspartate protease-3，Cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-10276R、bs-5570R、bs-6951R、bs-0876R、bs-0023R、bs-5368R、bs-5241R、bs-0081R、bs-20352R、bs-4564R）；增强化学发光（ECL），超敏化学发光液（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：34580）。

1.3 细胞培养 人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞株复苏后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养，培养设置条件：5%二氧化碳、恒温37 ℃、饱和湿度，每2天换液1次，观察并记录细胞生长状态。取对数生长期MCF-10A细胞和MCF-7细胞分别给予DMSO（空白对照组）、终浓度200、400、800 mg/L的藏红花素溶液［10］和15 mg/L的LY294002溶液［11］。

1.4 MTT法测定细胞增殖抑制率 药物干预48 h后，滴加0.25%胰酶进行消化后计数细胞、制备浓度1×105个/mL单细胞悬液，100 μL/孔接种于96孔培养板，每组设10个复孔。10 μL/孔加入浓度5 μg/mL的MTT溶液，继续培养4 h后更换培养液并加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO）终止反应，通过酶标仪检测各组细胞490 nm处吸光度值（A490 nm）。

增殖抑制率（%）=（1-A实验组）/A空白对照组×100%

1.5 细胞克隆实验检测细胞克隆能力 药物干预48 h后更换不含药培养基，继续常规培养14天后离心（离心半径10 cm，1500 r/min离心5 min）取细胞，经PBS溶液洗涤后，4%多聚甲醛溶液固定15 min、0.5%结晶紫染液染色30 min并晾干后，通过显微镜观察并计数细胞。

1.6 Annexin V-FlTC染色法检测细胞凋亡水平 药物干预48 h后，滴加0.25%胰酶进行消化后计数细胞、制备浓度1×106个/mL单细胞悬液，1 mL/孔接种于96孔培养板，每组设10个复孔。500 μL/孔滴加浓度1%的FITC染液并避光孵育10 min后通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.7 Western blot法检测细胞蛋白表达 药物干预48 h后离心（离心半径10 cm，1500 r/min离心5 min）取细胞，4 ℃超声破碎处理后离心（离心半径10 cm，12 000 r/min离心20 min）取上清，二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白浓度、沸水浴变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、5%脱脂牛奶封闭1 h，滴加一抗4 ℃孵育12 h，滴加二抗37 ℃孵育1 h，用磷酸盐缓冲溶液充分洗涤后滴加ECL显色，运用凝胶成像系统获得条带；以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达。

1.8 统计学方法 运用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，计量资料以方式表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 藏红花素对人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞克隆能力的影响 与空白对照组相比，200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-10A细胞克隆数目差异均无统计学意义（P＞0.05），400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞克隆数目较空白对照组显著降低（P＜0.01）；与LY294002组相比，800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞克隆数目显著降低（P＜0.05）。见图1—2、表1—2。

表1 藏红花素对人正常乳腺MCF-10A细胞增殖抑制率、克隆数目和凋亡率的影响（）

表1 藏红花素对人正常乳腺MCF-10A细胞增殖抑制率、克隆数目和凋亡率的影响（）

组别空白对照组藏红花素200 mg/L组藏红花素400 mg/L组藏红花素800 mg/L组LY294002 15 mg/L组复孔数10 10 10 10 10增殖抑制率（%）4.13±0.45 4.36±0.48 4.29±0.46 4.34±0.49 4.35±0.48克隆数目（个）762.40±164.21 796.50±173.59 804.60±154.36 798.10±177.42 787.20±163.07凋亡率（%）3.41±0.40 3.62±0.47 3.59±0.45 3.71±0.48 3.65±0.46

表2 藏红花素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率、克隆数目和凋亡率的影响（）

表2 藏红花素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率、克隆数目和凋亡率的影响（）

注：与空白对照组比较，**表示P＜0.01；与LY294002 15 mg/L组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

凋亡率（%）2.86±0.34 13.54±1.72**21.73±3.08**34.28±5.10**△△27.35±4.82**组别空白对照组藏红花素200 mg/L组藏红花素400 mg/L组藏红花素800 mg/L组LY294002 15 mg/L组复孔数10 10 10 10 10增殖抑制率（%）3.95±0.42 16.31±2.84**25.06±5.15**39.62±6.19**△33.70±5.03**克隆数目（个）1952.86±248.41 1680.95±231.62 1427.64±218.59**1245.57±184.30**△1481.06±209.21**

图1 各组人正常乳腺MCF-10A细胞克隆形成状况

图2 各组人乳腺癌MCF-7细胞克隆形成状况

2.2 藏红花素对人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 较空白对照组，200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-10A细胞增殖抑制率差异均无统计学意义（P＞0.05），400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞增殖抑制率升高（P＜0.01）；与LY294002组比较，800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞增殖抑制率升高（P＜0.05）。见表1—2。

2.3 藏红花素对人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响 较空白对照组，200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-10A细胞凋亡水平差异均无统计学意义（P＞0.05），200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞凋亡水平升高（P＜0.01）；较LY294002组，800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞凋亡水平升高（P＜0.01）。见图3—4，表1—2。

图3 各组人正常乳腺MCF-10A细胞凋亡状况

图4 各组人乳腺癌MCF-7细胞凋亡状况

2.4 藏红花素对人乳腺癌MCF-7细胞Pl3K、p-Pl3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达的影响 400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达较空白对照组下调（P＜0.01），PI3K、Akt、GSK-3β磷酸化率（p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β）较空白对照组降低（P＜0.01）；800 mg/L藏红花素组与LY294002组比较，各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。表3—5，见图5。

表3 藏红花素对人乳腺癌Pl3K、p-Pl3K蛋白相对表达量及Pl3K磷酸化率的影响（）

表3 藏红花素对人乳腺癌Pl3K、p-Pl3K蛋白相对表达量及Pl3K磷酸化率的影响（）

注：与空白对照组比较，**表示P＜0.01

p-PI3K/PI3K 0.54±0.11 0.46±0.09 0.24±0.06**0.12±0.03**0.14±0.04**组别空白对照组藏红花素200 mg/L组藏红花素400 mg/L组藏红花素800 mg/L组LY294002 15 mg/L组复孔数10 10 10 10 10 PI3K/β-actin 0.95±0.24 0.93±0.28 1.04±0.25 1.01±0.26 0.97±0.25 p-PI3K/β-actin 0.51±0.13 0.43±0.10 0.26±0.07**0.12±0.03**0.14±0.03**

表4 藏红花素对人乳腺癌Akt、p-Akt蛋白相对表达量及Akt磷酸化率的影响（）

表4 藏红花素对人乳腺癌Akt、p-Akt蛋白相对表达量及Akt磷酸化率的影响（）

注：与空白对照组比较，**表示P＜0.01

p-Akt/Akt 0.91±0.24 0.72±0.20 0.54±0.16**0.27±0.08**0.32±0.10**组别空白对照组藏红花素200 mg/L组藏红花素400 mg/L组藏红花素800 mg/L组LY294002 15 mg/L组复孔数10 10 10 10 10 Akt/β-actin 1.12±0.27 1.09±0.29 1.03±0.26 1.10±0.27 1.05±0.28 p-Akt/β-actin 1.02±0.28 0.78±0.22 0.56±0.14**0.30±0.05**0.34±0.06**

表5 藏红花素对人乳腺癌GSK-3β、p-GSK-3β蛋白相对表达量及GSK-3β磷酸化率的影响（）

表5 藏红花素对人乳腺癌GSK-3β、p-GSK-3β蛋白相对表达量及GSK-3β磷酸化率的影响（）

注：**表示与空白对照组比较，P＜0.01

p-GSK-3β 0.69±0.19 0.62±0.17 0.24±0.07**0.18±0.05**0.22±0.06**组别空白对照组藏红花素200 mg/L组藏红花素400 mg/L组藏红花素800 mg/L组LY294002 15 mg/L组复孔数10 10 10 10 10 GSK-3β/β-actin 0.93±0.26 0.91±0.23 0.92±0.25 0.90±0.22 0.92±0.24 p-GSK-3β/β-actin 0.64±0.18 0.56±0.15 0.22±0.06**0.16±0.04**0.20±0.05**

图5 各组人乳腺癌MCF-7细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达

2.5 藏红花素对人乳腺癌MCF-7细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达较空白对照组上调，而Bcl-2表达较空白对照组下调（P＜0.01），Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）；800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达较LY294002组上调，且Bax/Bcl-2比值较LY294002组升高（P＜0.05或P＜0.01），其他指标两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6、图6。

表6 藏红花素对人乳腺癌Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比值的影响（）

表6 藏红花素对人乳腺癌Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及Bax/Bcl-2比值的影响（）

注：与空白对照组比较，**表示P＜0.01；与LY294002组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

组别空白对照组藏红花素200 mg/L组藏红花素400 mg/L组藏红花素800 mg/L组LY294002 15 mg/L组Bax/Bcl-2 0.38±0.07 0.53±0.11**1.09±0.20**3.56±0.68**△△2.47±0.49**复孔数10 10 10 10 10 Caspase-9/β-actin 0.08±0.02 0.23±0.04**0.35±0.07**0.61±0.13**△△0.19±0.05**Cleaved Caspase-3/β-actin 0.11±0.03 0.13±0.04 0.26±0.05**0.69±0.16**△△0.41±0.07**Bcl-2/β-actin 0.45±0.08 0.38±0.07 0.30±0.05**0.18±0.04**0.21±0.05**Bax/β-actin 0.17±0.04 0.20±0.05 0.33±0.07**0.64±0.11**△0.52±0.08**

图6 各组人乳腺癌MCF-7细胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达

3 讨论

乳腺癌属中医“乳岩”“乳石痈”“妒乳”等范畴，其病机为情志不舒、气血紊乱、肝气郁结［12-13］。藏红花首载于《本草纲目》，具有活血化瘀、凉血解毒之功效，藏红花素为藏红花的主要活性成分。本研究发现，400、800 mg/L藏红花素和LY294002能够明显提高人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率和凋亡率，降低MCF-7细胞克隆能力，800 mg/L藏红花素上述作用优于LY294002，提示藏红花素具有抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和诱导其凋亡的作用。

细胞凋亡是由多种基因调控的自主程序化死亡过程，细胞凋亡受阻是肿瘤细胞异常生长的重要因素。Cleaved Caspase-3参与细胞凋亡的启动与执行，是细胞内最重要的促凋亡因子［14］。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，其中Bax能够诱导线粒体膜通道异常开放，导致细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）释放入细胞质，而Cyt C能够剪切激活Caspase-3；主要表达于线粒体膜的Bcl-2能够与Bax形成异源二聚体，从而对线粒体膜通透性起到保护作用，因此Bcl-2表现为抑凋亡作用，因此Bax/Bcl-2比值能够反映二者对细胞凋亡的真实调控作用［15-16］。本研究发现，400、800 mg/L藏红花素和LY294002能够明显上调人乳腺癌MCF-7细胞Cleaved Caspase-3、Bax表达并下调Bcl-2表达，显著提高Bax/Bcl-2比值，800 mg/L藏红花素上述作用优于LY294002，这可能是藏红花素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的重要分子机制。

PI3K被磷酸化（p-PI3K）后能够诱导其下游效应分子Akt磷酸化（p-Akt）活化。GSK-3β是一种多效应激酶，具有诱导Cyt C释放并激活Caspase-3的生理活性，表现为促凋亡作用；而GSK-3β为Akt下游靶分子，p-Akt能够诱导GSK-3β磷酸化（p-GSK-3β）而失活。因此，PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在细胞凋亡过程中发挥着重要调控作用［17-18］。Caspase-9是Caspase-3重要的活化刺激因子，而既往研究发现，p-Akt能够诱导Caspase-9磷酸化失活，进而间接抑制Caspase-3活化［19］。本研究发现，400、800 mg/L藏红花素和LY294002能够明显下调人乳腺癌MCF-7细胞p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β表达，并降低磷酸化率；800 mg/L藏红花素组与LY294002组各指标差异无统计学意义，提示藏红花素具有抑制MCF-7细胞PI3K/Akt/GSK3β信号通路的作用。

综上所述，藏红花素具有诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用，其机制可能与抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路进而影响凋亡相关蛋白表达有关。本研究结果还需开展动物实验进行验证。