基于低场核磁共振的预包装即食牛肉保质期预测模型研究

董海胜，刘恒言，徐 楠，何凯锋，于燕波，兰海云，杜秉健，臧 鹏,*

（1.中国航天员科研训练中心，航天营养与食品工程重点实验室，北京 100094；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471000；3.深圳市绿航星际太空科技研究院，广东深圳 518000）

氢元素是有机生物体的主要组成之一，是蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素及水等膳食营养素的构成成分，在食品体系中广泛存在。低场核磁共振（Low Field-Nuclear Magnetic Resonance，LF-NMR）可通过对含氢元素物质的监测，实现在无损条件下观察样品中含氢元素的分布和变化规律，各类食品无损检测中得到广泛应用[1]。目前，低场核磁共振在肉品科学研究中的应用主要集中在肉和肉制品中水分含量和保水性[2]，肌原纤维蛋白凝胶性和变性，脂肪和质构特性[3]测定等方面。

预包装肉制品由于采用了高温灭菌工艺，达到了商业无菌的要求，在密封完好的状态下，通常不会因微生物导致保质期或食用品质受到影响。预包装肉制品的货架期主要受体系中水分迁移、脂肪氧化等影响。Straadt 等[4]用LF-NMR，并辅助以共聚焦激光扫描显微镜技术（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM），研究了鲜肉和煮制肉中的水分分布情况。利用NMR 弛豫图像（T22）测定外部纤维水分含量，发现鲜肉的持水性有所增加，这与重量分析法和CLSM 图像得到的结果一致，这表明随着肌原纤维数量显著增加，能够容纳更多的水分。肉制品在加工和贮藏过程中水分分布和迁移情况也可以利用LF-NMR 进行评定[5-7]，研究表明微生物发酵对肉制品水分分布和保水性变化有重要影响[8]，腌制和蒸煮过程会导致肌原纤维蛋白的变性[9]，可以通过测定弛豫时间，侧面反映肌原纤维蛋白的变性情况。低场核磁共振是一种新型的脂肪含量测定方法[10]，利用LF-NMR 技术，不仅可以测定脂肪含量，还可以对水分进行同时测定。在低频磁场中，脂肪中的氢原子发出特殊质子信号，这种信号的强度与氢原子的含量有关，而氢原子的含量与脂肪含量成比例，因此可以利用LF-NMR 检测该信号进而对脂肪含量进行分析测定[11-13]。由于LF-MNR 测定过程中不需要使用任何化学试剂，且操作简单，不侵入影响被测物品的内部组织结构[14]。很多研究表明，利用低场核磁共振技术可以描述多种食品体系中的脂肪含量和状态变化情况[15-19]。

本研究采用预包装即食牛肉为研究对象，通过常温及加速贮存实验，采集贮存期间样本的低场核磁谱信息，并同期测定样品水分、脂肪含量、过氧化值及酸价等指标，确定影响其感官品质的关键指标，以此作为保质期指示指标，建立基于低场核磁谱的保质期预测模型。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

航天即食牛肉罐头 实验室自研产品（取牛腱子肉，切块整形，冰水浸泡去血水，煮沸焯水，加八角、桂皮、花椒、小茴香、陈皮、草果与水制备获得的卤汁，卤煮45 min，分装成40 g/袋，包装材料为三层耐高温复合蒸煮袋（SPET/PA/CPP））；平板计数琼脂培养基 北京陆桥技术股份有限公司；磷酸盐冲液、无菌生理盐水、冰乙酸、异辛烷、碘化钾、硫代硫酸钠、石油醚、碳酸氢钠、重铬酸钾、乙醚、异丙醇、氢氧化钠、酚酞指示剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；试剂采用超纯水配制。

MesoMR23-060 核磁共振成像分析仪 上海纽迈电子科技有限公司；DHP-9162 恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；JC-JZ-08 无菌均质器 上海净信实业发展有限公司；ZDJ-4B 自动电位滴定仪、UPM-N15L 超纯水机、PHSJ-4A pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；ATY124 分析天平 岛津企业管理（中国）有限公司；DFY-200C 高速粉碎机山东泽荣机械设备有限公司；SHB-IIIA 真空泵 林茂科技（北京）有限公司；DZF-6020 真空干燥箱 上海仪天科学仪器有限公司；J-3 菌落计数器 江苏天翎仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 即食牛肉的贮存与加速 由范德霍夫规则[20]方程式K（T+10）/K（T）≈γ（2～4）可知，化学反应速率受温度影响，且温度每升高10 ℃，反应速率提高2～4 倍。将即食牛肉于常温下25 ℃±2 ℃贮存，并35 ℃±2 ℃、45℃±2 ℃温度下（以下记25、35、45 ℃）进行加速试验判断货架期终点。

1.2.2 储藏特性指标检测 菌落总数：检测方法为GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[21]，贮存第0、180、360 d 各1 次；

感官评价指标：参考GB/T 38493-2020《感官分析 食品货架期评估（测评和确定）》，采用九点喜好度评分法进行适应性改进，贮存第0、60、120、180、210、240、270、286、300、316、330、346、360 d 各一次；

含水量：检测方法为GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》第二法的减压干燥法[22]，贮存第0、60、120、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450d 检测；

含油量：检测方法为GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[23]，贮存第0、60、120、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450 d 检测；

酸价和过氧化值：检测方法分别为GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》[24]和GB 5009.227-2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》[25]。贮存第0、60、120、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450 d 检测。

1.2.3 NMR 特征参数测定 用于航天即食牛肉检测的仪器参数设定如下：90°脉冲时间P90（μs）=22，180°脉冲时间P180（μs）=42，采样点数TD=180024，采样频率SW（kHz）=200，重复扫描次数NS=8，重复扫描等待时间TW（ms）=1500，回波个数NECH=4000；每组4 个平行样，每隔7～10 d 进行一次测试，每个样品重复测定3 次。使用纽迈核磁共振分析软件及CPMG 序列采集样品T2信号及信号量A2[15]。

1.3 数据处理

实验各检测指标取两次重复检测的平均值。采用Excel 2019、SPSS 进行数据整理分析及显著性检验，数据处理采用偏最小二乘法、主成分分析法等数据处理与统计分析方法。

2 结果与分析

2.1 储藏特性指标检测结果

随着贮存天数的增加预包装即食牛肉微生物变化结果见表1，可知贮存期内微生物指标无明显变化。

表1 航天即食牛肉微生物检测结果Table 1 Results of microbiological detection of instant beef

感官品质的变化见表2，外观变化见图1。由于45 ℃加速储存样本在第240 d 已质地硬，色泽深，不可接受，故未在图1 中展示。

图1 预包装即食牛肉25 ℃和35 ℃贮存270 d 后色泽变化Fig.1 Color changes of pre-packaged instant beef after storage at 25 ℃ and 35 ℃ for 270 d

表2 航天即食牛肉感官评价结果Table 2 Results of sensory evaluation of instant beef

从图2 的结果可见，含水量随着贮存时间的延长成逐渐降低趋势，尤其是在45、35 ℃贮存试验中后期降低幅度较大，导致了感官接受性差。含水量的下降主要是因为高温加速试验带来的包装材料透湿性的增大造成；另外含油量在高温加速试验组有升高，主要是由于含水量的降低带来的含油量相对增加，常温贮存含油量变化不明显；过氧化值试验期间呈波动上升趋势；酸价在高温加速试验组随着贮存时间延长呈波动上升趋势，常温贮存组变化不明显。从以上结果可判定感官接受性是航天即食牛肉贮存期间的强指示性指标，酸价具有一定的指示性，但牛肉产品质量标准中未对酸价进行规定，因此无判定标准。本试验依据感官接受性判定35 ℃贮存下航天即食牛肉的贮存寿命为360 d，45 ℃贮存寿命为210 d，依据ALST 方程[26]推算出25 ℃贮存下航天即食牛肉的货架期为540 d。

图2 预包装即食牛肉理化指标检测结果Fig.2 Test results of physical and chemical indicators of prepackaged instant beef

2.2 NMR 特征参数测定结果

利用核磁共振CPMG 序列采集样品的T2 衰减曲线，详见图3，纵坐标代表 核磁信号幅度，与样本中含氢量成正比。横坐标为样本衰减时间，样本中整体水分流动性越强，衰减越快。弛豫时间T2 的大小代表水分流动性的强弱，水分结合得越紧密弛豫时间越短[27]。各种弛豫时间对应的峰面积占总面积的比例表示各种水的相对含量，包括T21（0.01～2 ms）、T22（2～15 ms）、T23（15～300 ms）。其中T21表示与蛋白质分子表面极性基团紧密结合的水分子层，即结合水，其对应的峰积分面积为A21；T22表示不易流动水，其对应的峰积分面积为A22；T23表示自由水，其对应的峰积分面积为A23。

图3 预包装即食牛肉CPMG 序列Fig.3 CPMG sequence of pre-packaged instant beef

预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下T21、T22、T23、核磁信号强度、A21%、A22%、A23%变化分别见图4～图10。结果表明，T21（图4）无明显变化（贮存第230 d 时检测数据异常增高，可能为数据异常点），提示预包装即食牛肉中结合水未发生变化；T22（图5）、T23（图6）的下降表明了产品的流动性在变差，且T22在35 ℃贮存下降低幅度明显大于25 ℃贮存下，提示加速实验组不可流动水发生了较大的变化；核磁信号强度（图7）随着贮存温度升高而降低，提示加速实验样品总水损失高于常温贮存样品，而且随着时间的延长损失加剧，这与图2 含水量变化是相一致的；A21%（图8）、A22%（图9）在35 ℃贮存下升高幅度明显大于25 ℃贮存下，提示随着温度的升高，由于自由水的损失量增大，造成了结合水、不可流动水所占比例越来越高。A23%（图10）在35 ℃贮存下降低幅度明显大于25 ℃贮存下，提示随着温度的升高，自由水的损失加剧。

图4 预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下T21 随时间变化Fig.4 T21 changes with time of pre-packaged instant beef under storage at 25 and 35 ℃

图5 预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下T22 随时间变化Fig.5 Changes of T22 with time for pre-packaged instant beef under 25 and 35 ℃ storage

图6 预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下T23 随时间变化Fig.6 T23 changes with time for pre-packaged instant beef under 25 and 35 ℃ storage

图7 预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下T2 总信号强度随时间变化Fig.7 Total signal intensity of T2 varies with time of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃

图8 预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下A21 所占比例随时间变化Fig.8 Changes in the proportion of A21 of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃ over time

图9 预包装即食牛肉25、35 ℃贮存下A22 所占比例随时间变化Fig.9 Changes in the proportion of A22 of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃ over time

图10 航天即食牛肉25、35 ℃贮存下A23 所占比例随时间变化Fig.10 Changes in the proportion of A23of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃ over time

以上结果可见横向弛豫时间很好地反映了航天即食牛肉在贮存过程中各种水的变化，间接反映了品质变化。以横向驰豫时间的总信号量即T21、T22、T23各部分所代表的不同状态水的含量和贮存试验过程中理化分析所测的样品的实际含水量进行相关分析，见图11～图12。

图11 航天即食牛肉25 ℃贮存下总信号量和含水量相关性Fig.11 Correlation between total signal content and moisture content of aerospace instant beef stored at 25 ℃

图12 预包装即食牛肉35 ℃贮存下总信号量和含水量相关性Fig.12 Correlation between total signal content and moisture content of pre-packaged instant beef stored at 35 ℃

从图11～图12 可见含水量与总信号量A 具有显著相关性（P<0.05），25 ℃下的相关系数R为0.8266，主要是因为含水量变化范围太窄（38.5～41.0 g/100 g），35 ℃下的相关系数R高达0.9851，含水量变化范围（19.2～40.5 g/100 g）。

2.3 航天即食牛肉保质期预测模型的建立与验证

对采集的336 条常温贮存牛肉的CPMG 序列数据文件进行谱图处理，用OPUS 软件[28]，采用PLS 建立校正集样品贮存时间数学模型，通过模型优化，确定选取图谱范围720.87～629.97 ms，540.9～0.6 ms，作为分析谱区，谱图预处理方法为一阶导数。模型采用内部交叉验证，建模集相关系数（r）为0.94，校正标准差（RMSECV）为35，相对分析误差（RPD）为3.1，自动优化后SECV 随Rank 变化的趋势图见图13。

图13 自动优化后RMSECV 随Rank 变化趋势Fig.13 RMSECV changes with Rank after automatic optimization

预包装即食牛肉感官品质变化主要受产品的水分含量变化以及酸价和过氧化值变化影响。水分含量的变化会导致预包装即食牛肉的口感变硬。酸价和过氧化值的变化会导致预包装即食牛肉风味发生劣变，并产生氢过氧化物。最终导致油脂中醛，酮、酸等小分子物质逐渐积累，表现出强烈的不良风味及一定生理毒性[29]。水分含量变化以及酸价和过氧化值的升高最终会导致预包装即食牛肉感官接受性降低，是影响产品的保质期的主要因素。因此，采用感官接受性作为预包装即食牛肉保质期的预测和鉴定标准，对10 个分别贮存一定时间但未参与建模的样本分别进行距货架期终点的时间预测，预测结果详见表3，建模集的预测值与实测值之间的拟合图见图14。预测结果与实测值的相关性达0.99，预测结果的误差范围为0.7%～9.9%，RMSEP 为13.6。

图14 牛肉距货架期终点时间预测模型Fig.14 Prediction model of beef to end of shelf life

表3 牛肉常温贮存距货架期终点的时间预测结果Table 3 Prediction results of time from the end of the shelf life of beef stored at room temperature

3 结论

从航天即食牛肉25、35 ℃贮存下T21、T22、T23和A21%、A22%、A23%和A 总量的变化可见横向弛豫时间很好的反映了航天即食牛肉在贮存过程中各种水的变化，建立了航天即食牛肉含水量和A 总量相关关系，在含水量变化范围19.2%～40.5%内，相关系数r高达98.4；采用PLS 建立校正集样品贮存时间数学模型，通过模型优化，确定选取720.87～629.97 ms，540.9～0.6 ms，作为分析谱区，谱图预处理方法为一阶导数。模型采用内部交叉验证，建模集相关系数（r）为0.9405，校正标准差（RMSECV）为34.5，相对分析误差（RPD）为3.1，对10 个分别贮存一定时间但未参与建模的样本分别进行距离货架期终点的预测，预测结果与实测值的相关性达0.99，预测结果的误差范围为0.7%～9.9%，RMSEP 为13.6，预测模型的精确度满足货架期预测的精度要求。研究建立的方法模型对同类型高温复合蒸煮袋包装的肉制品保质期预测具有一定的参考意义，对其他类型包装材料或食品的保质期预测仍需进一步进行针对性的分析建模。

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