富锗木耳菌丝体不同溶剂提取物的体外抗氧化能力

朱雨馨，王文斌，王佳婧，朱蕴兰,*，张翼飞，徐 薛，戴永琪

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏省食品生物加工工程技术研究中心，江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州 221018；2.南京中医药大学，江苏南京 210046）

木耳（Auriculariaauricula）又名黑木耳，属担子菌纲，木耳目，木耳科真菌[1]。木耳是一种营养丰富的药食两用真菌[2]，多分布于北半球温带气候区域，主要分布在中国、日本、韩国等国家，其中以我国分布最多，我国木耳种植范围比较广泛，全国大部分地区均有种植[3]。木耳口感细嫩，风味特殊，富含蛋白质、多糖、维生素以及胡萝卜素和铁、磷等多种微量元素[3-4]，具有补气、充饥、促进核酸代谢、免疫调节、降血糖、抗血栓、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、抗炎、延缓衰老等功效[5-8]，可防止心肌梗塞以及预防和治疗高脂血症、动脉硬化、冠心病，减少心血管疾病的发病率[9-10]。此外还可以促进胃肠道的蠕动，有助于体内代谢废物的排除，预防便秘和结肠癌的发生，同时可以防止肥胖并预防和治疗多种老年疾病，是广为人知的一种重要保健食品[11-12]。

锗是一种自然界含量较少的微量元素，锗在土壤中的含量大约是0.6～1.3 μg/g[13]，而在食用菌菌丝体中却有含量很高的有机锗[12,14]。有机锗对癌细胞的生长和转移有明显的抑制效果，人体各组织器官中均有锗的存在，许多酶及大脑均含有锗，细胞壁、内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体等亚细胞组分和细胞基质中也含有锗[15]。成年人每日通过食物摄入锗的量平均为0.4～3.5 mg，绝大部被胃肠道吸收，进入血液在体内循环[16]。人体的各组织对锗没有选择性，并且无蓄积作用，无机锗对人体毒性较大，而有机锗对人体是有益的，是人体健康需要的微量元素，具有较好的提高人体免疫力的能力。研究表明有机锗具有保健、延年益寿、抗衰老、抗肿瘤、降压、强心等作用，还具有提高免疫力、参与核酸代谢、预防疾病、增白美容等功效[17-21]。食药用真菌对微量元素具有极强的富集和转化作用，并且能够将无机态微量元素通过自身的代谢结合到大分子活性物质上转化为有机态，从而降低了无机元素对人体的毒害作用，并提高了人体对微量元素的有效利用率[21-24]。食药用真菌富集的有机态微量元素与蛋白质、氨基酸、多糖结合在一起形成化合物，易于被人体吸收利用[21]。微量元素被食药用真菌富集后具有良好的稳定性，便于贮存和运输。富集微量元素的食用菌除了具有能量低、口味鲜美和营养丰富的特点以外，还能增加食用菌的多糖、蛋白质、氨基酸、鸟苷、胞苷等活性物质含量[21-24]。有关食用菌富集锗的研究已有文献报道[21-24]，但木耳富锗菌丝体的抗氧化能力的研究还未见报道，本研究通过液体发酵富集培养获得富锗木耳菌丝体，通过不同极性的溶剂进行提取其活性物质，并研究其活性物质的体外抗氧化活性，为进一步研究和开发具有生物调节能力的功能性食品开辟一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木耳（AuriculariaauriculaXE-987）徐州市丰县大山河食用菌合作社提供；琼脂粉、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、30%过氧化氢、浓盐酸、无水乙醇、95%乙醇、邻苯三酚、硫酸亚铁、氧化锗、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羟甲基胺基甲烷、邻二氮菲、Na2CO3、焦性没食子酸、福林酚试剂等均为分析纯、芦丁标准品、白桦脂醇标准品 上海源叶生物科技有限公司。

HH-B11-500-BS-Ⅱ型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；YXQ-LS-18SL 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司；SW-CJ-1F 型无菌操作台 苏净集团安泰公司；FA2104N 分析天平 上海精密科学仪器有限公司；HYG-型旋转式摇床 上海欣蕊自动化设备有限公司；TU-1810 型紫外可见分光光度计、TAS-990 型原子吸收分光光度计 北京析普通用仪器有限责任公司；SENCO.R206 型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；SHBIIIS 型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；LGJ-18A 冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；XT-9900 型智能微波消解仪、XT-9700 型冷却机中国上海新拓微波溶样测试技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及富锗木耳培养 固体斜面培养基：4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、2%琼脂、去离子水。

液体摇瓶培养基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、麦麸1%、豆粉1%、硫酸镁0.15%、磷酸二氢钾0.2%、氧化锗（350 μg/mL）、去离子水。

富锗木耳培养：将木耳斜面菌种转接到新鲜斜面上，22 ℃恒温培养至菌丝长满试管，将固体斜面培养基中活化好的菌种取3～4 块6～10 mm2大小的菌苔接入摇瓶培养基（装样量为100 mL/250 mL 三角瓶）中，22 ℃恒温箱中静置24 h，然后转到回转式恒温调速摇瓶机中，25 ℃，转速100 r/min，培养5～7 d。

1.2.2 富锗木耳菌丝体有机锗含量的测定 参考文献[12]的方法进行测定。将富锗木耳菌丝体干燥后用粉碎机粉碎，过60 目筛子，将粉末装入透析袋流水透析2 d，经微波消解仪消解后定容到10 mL，用原子吸收分光光度计在波长265.2 nm 下，测定样品吸光值。通过与锗标准曲线和回归方程计算有机锗含量。

1.2.3 富锗木耳菌丝体提取物的制备

1.2.3.1 菌丝体的收集 将发酵液取出，真空抽滤，用玻璃棒轻轻拨动聚集滤纸上留下的菌丝。将菌丝体置于培养皿中，置于冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，得到干燥的菌丝体。

1.2.3.2 富锗木耳菌丝体提取物的制备及得率计算

取干燥并研磨粉碎后的菌丝体干粉，取2 g 用滤纸包裹好。在滤纸上用棉线绑定包好，防止菌丝体干粉漏出。把滤纸包放入索氏提取器抽提筒中，分别用200 mL 去离子水，200 mL 70%乙醇，200 mL 乙酸乙酯加热回流提取1 h，过滤得第一次提取物，将滤渣用同样的方法获得第二次、第三次提取物，合并3 次滤液。将提取后的合并滤液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至膏状，放入冷冻干燥机中冷冻干燥24 h 后，取出称重后，放入冰箱，备用。

式中：m：提取物干燥后质量（g）；M：提取用原料质量（g）。

1.2.4 相关活性物质含量测定 多糖含量测定：参考文献[25]的方法，以95%乙醇调节醇沉浓度为70%进行沉淀多糖，以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。葡萄糖标准品吸光值A490nm 线性关系良好，测定的葡萄糖标准曲线回归方程为y=0.0152X+0.0066，R2=0.9981。样品中多糖含量以葡萄糖当量GCE（Glucose equivalent，GCE）表示，mg GCE/g DW。

总酚含量测定：参考文献[26]的方法，以没食子为标准品，采用福林-酚法测定样品中的总酚含量。样品中总酚含量以没食子酸当量GAE（Gallic acid equivalent，GAE）表示，mg GAE/g DW。没食子酸标准品在750 nm 下的吸光值A750nm 线性关系良好，标准曲线回归方程为 y=104.34x-0.0243，R2=0.9974。

总黄酮含量测定：参考文献[27]的方法，以芦丁为标准品，采用Al（NO3）3法测定样品中的黄酮含量。样品中总黄酮含量以芦丁当量RTE（Rutin equivalent，RTE）表示，mg RTE/g DW。芦丁标准品在510 nm 下的吸光值A510nm 线性关系良好，得到的标准曲线方程为y=0.0029X+0.0052，R2=0.9983。

1.2.5 富锗木耳提取物抗氧化能力测定 抗氧化能力的测定以正常培养的木耳菌丝体提取物为空白对照，以VC为阳性对照。

1.2.5.1 富锗木耳提取物对超氧阴离子自由基清除能力测定 借鉴文献[28]的方法，取0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液（pH8.2，25 ℃保温）4.5 mL，加入供试提取液0.1 mL，混匀。加入预热至25 ℃的2.25 mmol/L 邻苯三酚溶液（用10 mmol/L 盐酸溶液配制）0.4 mL，迅速混匀。在25 ℃下，波长325 nm时，每隔0.5 min 测一次吸光度值，直到4 min 时停止，计算吸光度的变化值（∆A样品=A4min-A0min）。用水0.1 mL 代替供试提取液测定邻苯三酚自氧化的速率（∆A空白）。比较供试提取液抑制邻苯三酚自氧化的程度，从而分析其对超氧阴离子自由基的清除能力的强弱。清除率的计算公式为：

式中：∆A样品为加入测试样品的每分钟吸光值的变化值；∆A空白为加入水替代样品的每分钟吸光值的变化值。

1.2.5.2 富锗木耳提取物对羟自由基清除能力测定

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[29]：分别向3 支试管中加入1.5 mL 5 mmol/L 的邻二氮菲溶液，然后同时加入4 mL pH7.4（0.75 mol/L）磷酸钠盐缓冲液，立即混匀，再马上加入1 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，立即混匀。然后分别向试管1 中加入1 mL 待测的样品溶液，试管2 和试管3 中加入1 mL 蒸馏水，再分别向试管1 和试管2 中加入1% H2O2溶液1.0 mL，试管3 中加入1 mL 蒸馏水，轻轻混匀，37 ℃，保温1 h 后分别测定3 支试管中溶液在536 nm 波长下的吸光值，每组做3 个重复。

清除率的计算公式为：

式中：A2为加入样品溶液及H2O2测得的吸光值；A1为不加样品溶液而加H2O2测得的吸光值；A0为样品溶液和H2O2两者都不加测得的吸光值。

1.2.5.3 富锗木耳提取液对DPPH 清除能力测定参考文献[10]方法。将不同浓度的提取液2 mL 与2 mL 2×10-4mol/L DPPH 无水乙醇溶液均匀混合，30 min 后在525 nm 处测定其吸光值，同时用同法测定2 mL 2×10-4mol/L DPPH 无水乙醇溶液与2 mL蒸馏水混合后的吸光值，以及2 mL 不同浓度提取液与2 mL 蒸馏水混合后的吸光值。

清除率计算公式为：

式中：Ai为加入样品和DPPH 无水乙醇溶液测得的吸光值；Aj为加入样品和蒸馏水测得的吸光值；A0为加入DPPH 无水乙醇溶液和蒸馏水测得的吸光值。

1.2.5.4 综合抗氧化能力 参考文献[30-31]方法。综合抗氧化能力，以超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH 清除率进行评价，评价采用模糊数学中的隶属函数值法和权重法，三种溶剂的权重系数均为1/3。每种溶剂提取物的抗氧化能力的隶属函数值为对超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH 清除能力的平均值。隶属函数值按公式计算。

式中：R 为函数值；Xi为指标测定值；Xmax为所有测定样品某一指标的最大值；Xmin为所有测定样品某一指标的最小值。

1.3 数据处理

所有试验重复3 次，结果以平均值±标准差表示；采用SPSS 21.0 软件对数据进行处理和方差分析，P<0.05 表示差异显著；采用皮尔森法（Pearson）进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 富锗木耳有机锗含量

经测定锗标准曲线回归方程为y=0.063x+0.0038，R2=0.992，富锗木耳菌丝体的有机锗含量为542.83 μg/g。

2.2 富锗木耳不同溶剂提取物的提取效果

经测定，富锗木耳不同溶剂提取物的得率实验结果如表1 所示。

表1 富锗木耳不同溶剂提取物得率Table 1 Extraction rates of germanium-rich A.auricula with different solvents

从表1 可以看出，水提取物的得率与70%乙醇提取物的得率没有显著差异（P>0.05）。乙酸乙酯提取物的得率最小，与其他两种溶剂提取物的得率相比，存在极显著差异（P<0.01）。随着溶剂极性的降低，提取物的得率下降。根据化学的“相似相溶”原理，可能由于木耳的各种化学成分含量的差异，导致各物质在不同溶剂中溶解度不同，从而使各个溶剂的提取率不同。各种提取物相应成分含量如表2 所示。

从表2 可以看出，多糖含量最高的是水提物，其次是70%乙醇提取物。总酚含量最高的是乙酸乙酯提取物，然后是70%乙醇提取物，水提物的总酚含量最少。黄酮含量最高的是乙酸乙酯提取物，其次是70%乙醇提取物和水提物。各种不同溶剂提取物的多糖、总酚和总黄酮含量之间存在极显著差异（P<0.01）。由于各种物质在不同极性中的溶解度不同，导致提取物含量不同。可能木耳成分中极性物质含量较多，导致水提物的得率较高。

2.3 富锗木耳提取物抗氧化能力分析

2.3.1 富锗木耳提取物对超氧阴离子自由基的清除作用 富锗木耳不同溶剂不同浓度提取物对超氧阴离子自由基清除能力的实验结果如图1 所示。

图1 不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of different solvent extracts on superoxide anion free radicals

由图1 得知，富锗木耳不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除率随着提取物浓度的升高而升高。不同溶剂富锗木耳提取物对超氧阴离子自由基的清除率彼此之间存在极显著差异（P<0.01）。不同溶剂提取物中，水提取物对超氧阴离子自由基的清除率最强，在实验浓度为9 mg/mL 时，水提取物对超氧阴离子自由基的清除率最高可达43.32%。对超氧阴离子自由基清除率次高的提取物是70%乙醇提取物，当实验浓度为9 mg/mL 时，70%乙醇提物对超氧阴离子自由基的清除率达到39.36%。从实验结果来看，富锗木耳菌丝体不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除能力比空白对照高，且有极显著差异（P<0.01）。但富锗木耳不同溶剂提取物对超氧阴离子自由基的清除能力均没有VC强。

2.3.2 富锗木耳提取物对羟自由基的清除作用 富锗木耳不同溶剂不同浓度提取物对羟自由基的清除效果的实验结果如图2 所示。

图2 不同溶剂提取物对羟自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of different solvent extracts

由图2 可知，富锗木耳不同溶剂提取物均对羟自由基有较好的清除作用。不同溶剂提取物对羟自由基的清除能力随着提取物溶液浓度的升高而增强。通过比较可知，相同浓度的提取物，对羟自由基的清除能力的大小顺序是：70%乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物。浓度为9 mg/mL 的70%乙醇提取物对羟自由基的清除率高达70.10%，可以看出70%乙醇提取物对羟自由基的清除能力较强。从图2 可以看出，富锗木耳菌丝体提取物在相同浓度情况下清除羟自由基的能力要比空白对照高，但富锗木耳不同溶剂提取物对羟自由基的清除能力均没有VC强。经方差分析，不同溶剂富锗木耳提取物对羟自由基的清除率彼此之间存在极显著差异（P<0.01），且与空白对照之间也存在极显著差异（P<0.01）。

2.3.3 富锗木耳提取物对DPPH 的清除作用 富锗木耳不同溶剂提取物对DPPH 的清除作用实验结果如图3 所示。

图3 不同溶剂提取物对DPPH 自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of different solvent extracts on DPPH free radicals

由图3 可知，富锗木耳提取物对DPPH 的清除能力随着提取物浓度的升高而升高，对于不同提取物清除DPPH 能力的大小顺序是：70%乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物，不同提取物对DPPH 的清除率具有极显著差异（P<0.01）。当提取物浓度为9 mg/mL 时，70%乙醇提取物对DPPH 的清除率最大为76.99%。通过与对照比较可以看出，富锗木耳菌丝体提取物在相同浓度情况下对DPPH 清除能力极显著（P<0.01）高于空白对照，但富锗木耳不同溶剂提取物对DPPH 的清除能力均极显著（P<0.01）低于VC。

2.3.4 富锗木耳不同溶剂提取物综合抗氧化能力分析 抗氧化能力是多项指标综合作用的结果，用单一指标评价抗氧化能力不能全面反映其真实状况，用多个指标进行综合评价才能体现其综合完整的抗氧化能力。为了较全面地反映其抗氧化性，运用隶属函数法，综合各项相关指标用平均隶属函数值对其抗氧化能力进行综合评价。通过对富锗木耳不同溶剂提取物抗氧化能力的隶属函数值的计算，结果如表3所示。

表3 不同溶剂提取物抗氧化能力隶属函数值Table 3 Membership function values of antioxidant capacity of extracts with different solvents

通过表3 的隶属函数值可以看出，70%乙醇提取物的综合抗氧化能力最佳，其次是水提取物，抗氧化能力最小的是乙酸乙酯提取物。总抗氧化能力随着提取物浓度的增加而增加。总体看，极性大的溶剂提取物的抗氧化能力强，极性小的抗氧化能力弱一些。

2.3.5 相关性分析 根据对不同溶剂提取物各物质含量的测定，并对各物质含量与其抗氧化能力进行相关性分析，结果如表4 所示。

从表4 可以看出，在水提取物和70%乙醇提取物中，多糖含量与多酚含量和黄酮含量均有显著正相关（P<0.05），多酚含量与黄酮含量也有显著正相关（P<0.05）；水提取物中多酚和黄酮含量均与乙酸乙酯提取物中多酚含量有显著正相关（P<0.05）。水提物中多糖、多酚和黄酮含量均与DPPH 自由基清除率有显著正相关（P<0.05）。70%乙醇提取物中多酚和黄酮含量均与超氧阴离子自由基清除率有显著正相关（P<0.05）；70%乙醇提取物中多酚含量与羟自由基清除率有显著正相关（P<0.05）。乙酸乙酯提取物中多酚含量与DPPH 清除率有显著正相关（P<0.05）。

综合表4 分析结果，可以得出多糖、多酚和黄酮含量均与DPPH 清除率有正相关；多酚含量与超氧自由基、羟自由基和DPPH 自由基的清除率均有正相关；黄酮含量与超氧自由基和DPPH 自由基清除率有正相关。

3 结论

不同溶剂提取物的提取率不同，水与70%乙醇提取物的提取得率较高，且无显著差异（P>0.05）。乙酸乙酯提取物的提取率较低。在水提取物中表现出多糖、多酚、黄酮含量的之间存在正相关。富锗木耳菌丝体不同溶剂提取物对自由基在实验浓度范围内均有一定的清除能力，都表现出随着提取物浓度的增加而增加的趋势。多糖和多酚及黄酮对超氧阴离子自由基的清除率均有显著影响（P<0.01），水提取物清除效果更显著（P<0.01）。70%乙醇提取物中多酚含量与羟自由基清除率有显著（P<0.05）正相关。多糖、多酚和黄酮含量均与DPPH 自由基清除率有显著正相关（P<0.05），醇提物对DPPH 清除率的影响更显著（P<0.05）。在不同溶剂提取物中，除了多糖、多酚、黄酮等物质外，还会有其他物质对自由基也有一定的清除作用。多糖、多酚和黄酮在清除自由基中均发挥不同的作用，70%乙醇提取物的综合抗氧化能力最佳，其次是水提取物，抗氧化能力最小的是乙酸乙酯提取物。总体看，极性大的溶剂提取物的抗氧化能力强，极性小的抗氧化能力弱。富锗木耳菌丝体提取物与空白正常培养的耳菌丝体提取物相比，具有更好的清除自由基的能力，富锗木耳在开发功能性食品方面具有一定潜力。

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