高效液相色谱-串联质谱法测定植物性食品中多种有机锡化合物

◎ 石声鑫，杨建英，徐 宁，陈晓红，陈 庆，肖晓槟

（广东省汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515041）

苯丁锡、三环锡、三丁基锡和三苯基锡等有机锡化合物被广泛用作木材防腐剂、防污涂料、聚氯乙烯（聚氯乙烯）稳定剂、工业催化剂和农业杀菌剂[1]。研究发现有机锡化合物在哺乳动物中会引起免疫毒性、神经毒性、皮肤和眼睛刺激、诱变性和致癌性等严重后果[2]。早在1999 年，TAKAHASHI 等[3]分析了从超市购买的各种样品，在被调查的烘焙羊皮纸上烘烤的饼干验证了有机锡化合物向食品转移的事实。随着人们对有机锡化合物研究的逐渐深入，越来越多的实验表明许多植物性食品中可能存在有机锡化合物残留，而食用这些食物会增加人体摄入有机锡化合物的风险。有机锡化合物在环境中稳定性较高，不易降解。这些化合物可以通过农业、海事活动、工业以及污水处理[4]等多种途径进入植物性食品。①有机锡化合物可以被释放到水体中，在水中溶解，并被植物吸收。随着植物的生长，有机锡化合物也会被植物积累。②有机锡化合物也可以通过土壤进入植物[5]。这些化合物可以被土壤吸附或与土壤微生物发生反应，在土壤中逐渐积累，还可以通过植物的根系吸收到植物体内。③空气中的有机锡化合物可以沉降到土壤中被植物的根系吸收或通过植物的叶片表面吸附进入植物。④有机锡化合物还可以通过食品包装材料进入植物性食品。

目前我国尚未出台关于液相色谱-串联质谱法测定有机锡化合物的现行标准，因此本文建立高效液相色谱-串联质谱仪测定食品中有机锡化合物的方法，以期为植物源食品中有机锡化合物的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及材料

QTRAP 5500 液相色谱-质谱联用仪；电子分析天平；旋涡振荡器；AH-50 全自动均质器；高速离心机。

一氯三甲基锡（TMT，纯度≥99%，迈迪嘉科技有限公司）； 苯丁锡（Fenbutatin oxide）、氯化三苯锡（TPHT）、三环锡（TCHT）、一氯三丙基锡（TPT），100 μg·mL-1，迈迪嘉科技有限公司；二氯二苯基锡（DPHT）、一氯三丁基锡（TBT），1 000 μg·mL-1，迈迪嘉科技有限公司；甲醇、乙腈（HPLC 级）；甲酸（HPLC 级）；乙酸铵（色谱纯）；盐析试剂包（乙酸钠）；盐析试剂包（无水硫酸镁）；净化试剂：C18、PSA、Carb、除脂分散净化剂（EMR）；超纯水；有机相针式过滤器（0.22 μm，尼龙）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

准确称取2.5 g 均匀试样（精确至0.001 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入2.5 mL 水，振荡涡旋3 min，加入5 mL 甲酸乙腈（甲酸1%），均质2 min，10 000 r·min-1离心5 min，转移上清液至另一个50 mL 离心管中，剩余残渣中再加入5 mL 甲酸甲醇（甲酸1%），涡旋振荡5 min，10 000 r·min-1离心5 min，合并两次提取液，加入混合盐析试剂（含2.5 g乙酸钠，0.5 g无水硫酸镁），手动振摇10 s 后，振荡器振荡2 min，8 000 r·min-1离心2 min。准确吸取2 mL 样液至15 mL 聚丙烯离心管中，再加入3 mL 水，涡旋5 s 后，吸取样液过0.22 μm尼龙滤膜，待分析。

1.2.2 标准溶液配制

（1）标准储备溶液。准确称取TMT标准物质适量，用乙腈配制成1 mg·mL-1的标准储备液；准确移取苯丁锡、TPHT、TCHT、TPT 标准溶液1 mL，用乙腈配制成10 μg·mL-1的标准储备液；准确移取DPHT、TBT 标准溶液1 mL，用乙腈配制成100 μg·mL-1的标准储备液。储备液于避光-20 ℃条件下保存。混合中间标准溶液：分别吸取适量的储备液，用乙腈稀释，配制成浓度为1 μg·mL-1的混合中间标准溶液。

（2）标准溶液的配制。分别吸取不同浓度的混合中间标准溶液，用乙腈（含1%甲酸）：水（2 ∶3，体积比）配制成浓度为0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1和10 ng·mL-1的标准溶液。

（3）基质匹配标准溶液的配制。空白基质按照“1.2.1”条件进行前处理，获得基质空白提取液，逐步用基质空白提取液将中间混合标准溶液稀成浓度为

0 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1基质标准工作溶液。

1.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱为Phenomenex Kinetex Biphenyl 柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10.0 μL；流动相：A 相为0.2 g·L-1乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸），B 相为0.1%甲酸乙腈，流速为0.3 mL·min-1，梯度洗脱。洗脱程序：0 ～1.0 min，20%B；1.0 ～3.0 min，90%B；3.0 ～5.0 min，90%B；5.0 ～6.0 min，20%B；6.0 ～8.0 min，20%B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正模式；采集方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；驻留时间50 ms；离子源喷雾电压（IS）：5 500 V；离子源加热温度：550 ℃。

2 结果与分析

2.1 实验条件优化

2.1.1 质谱条件优化

采用正离子扫描模式（ESI+）和负离子扫描模式（ESI-）对标准溶液进行母离子扫描。正模式下的离子丰度高于负模式下离子信号丰度，因此选择正离子扫描模式，确定各目标物的母离子，然后进行子离子扫描，同时在此基础上进一步优化子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数。优化结果详见表1。

表1 化合物保留时间、母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量表

2.1.2 液相条件的建立

在前期预实验中比较了0.1%甲酸水、0.2 g·L-1乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）、5 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液所组成的无机相；乙腈、0.1%甲酸乙腈、5 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸）甲醇组成的有机相系统。通过无机相与有机相的组合比较发现，流动相中加入少量甲酸后，可使目标物峰形尖锐，能增强离子信号强度值，而加入乙酸铵后，目标物峰形对称性好。以5 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液-5 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸）甲醇为流动相时，各个有机锡化合物的离子化效果及响应值最好；以0.2 g·L-1乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）-0.1%甲酸乙腈为流动相时，各个目标物的离子化效果及响应值较好。在实际样品分析时，发现以5 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液-5 mmol·L-1乙酸铵（含0.1%甲酸）甲醇为流动相时，苯丁锡的响应异常，采用等度洗脱[6]或者梯度洗脱，运行序列的前几个样品时信号值均有一定波动。综合考虑，采用0.2 g·L-1乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）-0.1%甲酸乙腈为流动相，经过优化之后得到的梯度洗脱条件见“1.3”。

2.1.3 提取方法的确定

水具有良好的组织渗透性，能分散样品，涡旋匀浆后能增加溶剂与样品的接触面积[7]，可确保极性药物化合物的回收率和稳定性，因此本文在提取样品过程中加少许水进行基质分散。含水量低和高pH 值的样品中，有机锡化合物回收率会降到70%以下[8]，萃取剂的pH 值对提取效率至关重要，实验通过添加1%甲酸降低提取过程中的pH 值以提高提取效率。甲醇和乙腈是提取有机锡化合物的两种常用溶剂，对于TBT、TPT，甲醇和乙腈的萃取效率相似；对于其他有机锡化合物的提取，甲醇和乙腈则各有优点[9]。因此实验中用乙腈和甲醇分别提取后合并提取液。加入混合盐析试剂（含2.5 g 乙酸钠，1.5 g 无水硫酸镁），振荡离心，目的是使萃取环境处于温和的pH 值下，确保目标化合物的稳定性，同时使基质中的水分与有机提取液完全分离，促进水相和有机相分层。

2.1.4 净化方法的确定

复杂样品提取物中的色素、脂肪、脂肪酸、糖等杂质可以通过纯化去除，有利于减少对检测的干扰。在QuEChERS 方法中，Carb、PSA、C18和EMR 通常被用作净化剂，本实验中考查了Carb、PSA、C18和EMR 等净化剂的回收率，在1 mL 浓度为10 ng·mL-1的混标溶液中加入20 mg 净化剂，振荡5 min 后离心，吸取200 μL 溶液与800 μL 水混合后上机，结果见图1。可以看出，Carb 对苯丁锡有明显的吸附，苯丁锡的回收率仅为22.01%；4 种净化剂对DPHT 均有一定程度的吸附，回收率在74.6%～84.9%，且C18、Carb、PSA 对TMT 有基质增强效应，回收率在120%以上。综合考虑之后，最终采用吸取2 mL 样液与3 mL 水混合后上机的方式以达到降低基质效应、溶剂效应，减少杂质等效果。

有机锡化合物图1 不同净化剂对有机锡化合物的回收率图

2.2 基质效应、线性关系、检出限、定量限

本实验采用相对响应值法评定基质效应，基质效应按公式（1）计算。

式中：ME为基质效应，%；Am表示空白基质标准响应值；Ac表示纯溶剂标准响应值。ME值在80%～120%表明基质效应可以忽略；ME值在50%～80%和120%～150%时，存在不可忽略基质效应。

选择草莓、苹果、柑橘、葡萄、黄瓜5 种具有代表性的复杂基质，通过实验分别获得7 种有机锡化合物的基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线（线性方程见表2），计算ME值。实验发现，有机锡化合物在5 种基质中均存在不可忽略基质效应，且以基质增强为主（表3）。因此，应通过基质匹配标准曲线进行定量，以更准确地反映植物性食品中有机锡化合物的含量。以峰面积（y）对有机锡化合物的质量浓度（x）作线性回归，有机锡化合物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r）均≥0.995，详见表2。以空白样品的3 倍信噪比确定检出限，10 倍信噪比确定定量限，方法检出限在0.2 ～4 μg·kg-1，定量限为0.5 ～10 μg·kg-1。

表2 不同基质中有机锡化合物的线性方程、相关系数、检出限、定量限表

表3 加标回收实验结果表

2.3 方法的准确度和精密度

选择不含有机锡化合物的草莓、苹果、柑橘、葡萄、黄瓜样品，在0.01 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.05 mg·kg-13 个加标浓度下进行加标回收率实验，每个水平重复6 次，回收率、精密度结果见表3。可以看出，在3 个加标水平下，7 种有机锡化合物的平均回收率在68.1%～103.1%，相对标准偏差在1.00%～11.36%，表明本方法的准确度和精密度良好。

2.4 样品测定

利用本方法对黄瓜、葡萄、苹果、柑橘各5 批次，共计20 批次样品进行有机锡化合物残留量检测。结果发现其中1 批次的柑橘样品检出DPHT（含量为0.015 mg·kg-1），其余样品均未检出本文涉及的7 种有机锡化合物。

3 结论

本研究以甲酸乙腈（甲酸1%）和甲酸甲醇（甲酸1%）为提取剂，提取剂经混合盐析试剂（含2.5 g乙酸钠，0.5 g 无水硫酸镁）除水分层，通过色谱和质谱条件的优化，建立了植物源食品中多种有机锡化合物的检测方法。该方法简便快捷、实用性强，方法学验证结果符合残留检测的相关要求，适用于植物源食品中多种有机锡化合物的快速检测。