植物乳植杆菌BXM2产γ-氨基丁酸的发酵条件优化及特性研究

◎ 朱永乐，宋贵梅，乔荣更，湛剑龙，赵大洲，吴琼琳

（厦门元之道生物科技有限公司，福建 厦门 361100）

γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA），又名氨酪酸[1]，为非蛋白质的天然氨基酸，常由生物体内转化而得[2]。GABA 作为一种活性氨基酸，具有促进机体葡萄糖代谢、降血压、镇静、抗焦虑、预防或治疗癫痫，改善肝脏、肾脏功能等多种作用[3-6]。目前GABA 已广泛应用于食品、保健品中，含GABA的主要产品有饮料、胶囊、压片糖果以及软糖等。

γ-氨基丁酸在天然物质中含量较低，无法满足工业上的需求[5-6]。目前获得γ-氨基丁酸的主要方法有植物富集法、化学合成法、微生物发酵法，与其他两种方法相比，微生物发酵法具有专一性强、生产周期短、环保、操作简单等优点[7-10]。植物乳植杆菌为可食用菌种，为微生物发酵法生产γ-氨基丁酸的主要菌种之一，在开发健康安全的GABA 功能性食品领域中具有重要意义[11]。然而，在发酵过程中，γ-氨基丁酸产量受多种因素的影响，不同来源的乳酸菌产γ-氨基丁酸的能力也各有差异。

本课题在前期工作中分离筛选得到植物乳植杆菌BXM2，以该菌株为研究对象，通过单因素实验和响应面实验以γ-氨基丁酸产量为响应值，对发酵条件进行优化，并对菌株耐胆盐、耐酸的特性进行研究，以期为后续研究菌株BXM2 功能及应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳植杆菌BXM2（Lactiplantibacillus plantarumBXM2）： 中国微生物菌种保藏中心（CGMCC NO.16436）；甲醇、乙腈、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠：西陇科学股份有限公司；邻苯二醛、四氢呋喃、巯基乙醇：阿拉丁试剂（上海）有限公司；三乙胺：西亚试剂；γ-氨基丁酸标品：北京中科质检生物技术有限公司；猪胆盐：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的活化

从-80 ℃冰箱中取出冻存的菌株植物乳植杆菌BXM2，于MRS 液体培养基中活化至二代，培养温度为37 ℃，培养时间为24 h，培养条件为厌氧培养，备用。

1.3.2 菌株耐受性分析

（1）耐酸实验。用稀盐酸将配制好的MRS 液体培养基的pH 值调节至1.5、2.5、3.5，于121 ℃灭菌15 min。待培养基冷却至室温后，将培养至二代的菌液以3%（体积分数）接种至培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养，并测定发酵2 h 的活菌数。

（2）耐胆盐实验。向MRS 液体培养基中添加0.03%、0.30%、0.50%的胆盐于121 ℃下灭菌15 min。待培养基冷却后向其加入3%的二代菌液，置于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养，测定发酵2 h 的活菌数。

1.3.3 发酵条件优化

以5%的菌株接种量向MRS 培养基中接入活化至二代的菌液，于37 ℃下培养24 h，取发酵液离心（5 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，取上清液并测定γ-氨基丁酸含量。

（1）单因素实验。按1%、3%、5%、7%和9%（体积分数）接入二代活化菌液，其余条件固定，测定培养基上清液γ-氨基丁酸含量；调整发酵时间为20 h、24 h、28 h、32 h 和36 h，其他条件固定，测定γ-氨基丁酸含量；调整发酵温度为27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃和45 ℃，其他条件固定，测定γ-氨基丁酸含量。

（2）响应面实验。在单因素实验的基础上进行响应面优化实验，以γ-氨基丁酸含量为响应值，使用Design Expert 10 对其进行分析，优化发酵工艺条件，因素水平设计见表1。

表1 响应面实验水平设计表

1.3.4 γ-氨基丁酸含量测定

本文采用高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸含量，检测器为紫外分光光度检测器，采用外标法进行定量。

（1）色谱条件。色谱柱：C18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相A：8 g·L-1结晶乙酸钠+三乙胺+四氢呋喃（pH 值为7.2±0.02）；流动相B：8 g·L-1结晶乙酸钠∶乙腈∶甲醇=1 ∶2 ∶2（体积比）（pH 值为7.2)；检测波长：338 nm；柱温：40 ℃；流速：0.8 mL·min-1。梯度洗脱程序见表2。

表2 洗脱程序表

（2）试剂及标准曲线绘制。衍生试剂：0.1 g邻苯二醛（OPA）+1 mL 乙腈+13 μL 巯基乙醇，用0.4 mol·L-1硼酸缓冲液定容至10 mL。氨基丁酸标准曲线的绘制：根据QB/T 4587—2013 方法有所调整，将标准溶液配制成浓度为12 μg·mL-1、22 μg·mL-1、42 μg·mL-1和58 μg·mL-1的系列溶液，添加等体积的衍生试剂，衍生2 min，并绘制标准曲线。得到回归方程为y=12 034.4x，R2=0.999 6。

1.4 数据处理

利用Excel 2021 处理数据，采用Origin 2018 作图，实验数据以平均值±标准差表示；通过SPSS 22.0 进行单因素方差分析（ANOVA），Duncan 法进行显著性差异分析（n=3）；由Design Expert 10 设计响应面实验。

2 结果与分析

2.1 菌种耐受性实验结果

益生菌进入人体胃肠道后可发挥本身的益生功能，但是乳酸菌的存活力会受到胃酸及胆盐的影响，因此对乳酸菌消化环境的耐受力筛选至关重要。体外消化模拟环境可为益生菌的定植能力提供理论依据[12]。研究表明，人体胃环境的pH 值一般在1.3 ～2.0，食物排空时间一般为1 ～2 h[13-14]。因此本实验选取pH 值为1.5、2.5、3.5，消化时间为2 h 进行实验。如图1（a）所示，发酵原液中活菌数与各pH 条件下消化2 h 的活菌数有显著差异（P＜0.05）；pH 值为1.5、2.5、3.5 的条件下，活菌数由原液中的9.2×108CFU·mL-1分别降至1.1×105CFU·mL-1、1.2×105CFU·mL-1、6×106CFU·mL-1。

图1 菌株BXM2 在不同pH、不同浓度胆盐条件下的活菌数变化图注：不同小写字母表示差异显著（P ＜0.05）。下同。

据报道，胆盐对乳酸菌的耐受性有一定影响，而人体胆汁中含有大量的胆盐[15]。从图1（b）中可以看出，BXM2 植物乳植杆菌对胆盐的耐受性与胆盐添加量呈负相关（P＜0.05）。胆盐浓度为0.50%、消化2 h 时，BXM2 植物乳植杆菌活菌数为9.8×105CFU·mL-1。

综上，BXM2 植物乳植杆菌在胆盐和酸性环境下均有一定耐受能力，能在发酵液中存活，有利于在肠道中定植，发挥益生功效。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 发酵时间

从图2 可以看出，随着发酵时间的延长，γ-氨基丁酸含量整体上呈先增大后降低的趋势。发酵时间为32 h时，γ-氨基丁酸含量达到最大值，为（153.55±8.76）μg·g-1；继续延长发酵时间，γ-氨基丁酸含量显著降低（P＜0.05），可能是由于发酵体系中菌种为满足自身营养需求充分利用了代谢产物[16]。

图2 发酵时间对γ- 氨基丁酸含量的影响图

2.2.2 发酵温度

如图3 所示，随着温度的升高，γ-氨基丁酸含量先增大后显著减小（P＜0.05），可能是温度的升高有利于乳酸菌生长和谷氨酸脱羧酶的产生[17]。当发酵温度为37 ℃时，γ-氨基丁酸的产量最大，其含量为（359.64±19.77）μg·g-1；当温度为42 ℃时其含量显著降低（P＜0.05），可能是温度过高，影响了菌株的生长。

图3 发酵温度对γ-氨基丁酸含量的影响图

2.2.3 接种量

如图4 所示，随着菌株接种量的增加，γ-氨基丁酸的含量先增大后减小。当接种量过小时，培养时间延长，导致生产率降低；当接种量过高时，会过早消耗培养基中的营养成分，进而消耗菌株生长过程中代谢产生的γ-氨基丁酸[18]；当菌株接种量为3%时，γ-氨基丁酸含量达到最大值，为（308.23±8.12）μg·g-1。

2.3 响应面优化实验

以单因素实验为基础，以γ-氨基丁酸含量（Y）为响应值，结合Box-Behnken 对发酵条件进行优化，响应面实验结果见表3，多元回归分析结果见表4。回归方程为Y=481.26+1.98A-0.25B+15.81C+18.01AB+13.43AC-1.05BC-70.63A2-53.29B2-24.83C2。方程模型显著，P＜0.05；失拟项R=0.637 2 ＞0.5，不显著。通过以上分析可以得出该模型可应用于预测植物乳植杆菌BXM2 最佳发酵条件下γ-氨基丁酸含量。从表4 可以得出，对BXM2 产γ-氨基丁酸含量影响的顺序为接种量＞发酵时间＞发酵温度。其中发酵时间和发酵温度二次项对γ-氨基丁酸含量有极显著影响，P＜0.01。

表3 响应面实验设计及结果表

表4 回归方程分析表

各因素对γ-氨基丁酸含量的交互影响见图5 ～图7。响应面曲线越陡峭，影响越明显，因素间交互作用越显著；等高线越趋近于椭圆形[19]，则说明两因素间的影响越显著。由此可知，发酵时间与发酵温度的交互作用与其他两组交互作用相比影响更加明显，与方差分析中结果一致。

图5 AB 交互作用图

图6 AC 交互作用图

图7 BC 交互作用图

经模型拟合得到的响应面优化实验结果为发酵时间32.18 h、发酵温度37.010 ℃、接种量3.66%，预测γ-氨基丁酸最含量为483.924 μg·g-1。考虑实验结果可能存在误差，将发酵条件调整为发酵时间32.2 h、发酵温度37 ℃、接种量3.7%，该条件下的γ-氨基丁酸含量为479.23 μg·g-1，与响应面预测值相比误差率为0.969%，实验数据与理论预测相差不大，由此说明该模型具有可靠性。

3 结论

本文通过单因素实验结合响应面优化实验对BXM2 发酵产γ-氨基丁酸的发酵条件进行优化，得到最佳的发酵条件为发酵时间32.2 h、发酵温度37 ℃、接种量3.7%，该条件下γ-氨基丁酸的含量为479.23 μg·g-1。通过测定BXM2 在不同pH 值、不同胆盐浓度下的活菌数，发现BXM2 具有良好的耐受力，有利于在肠道中定植，发挥益生功效，可选作优秀菌株进行研究与开发。