响应面优化羧甲基醚化法制备马蹄抗性淀粉的工艺及理化性质研究

◎ 吕艺扬

（仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225）

马蹄，又叫荸荠，在我国多地均有种植。其营养丰富，具有清热明目、生津止渴、清肺化痰、利肠通便等功效，含有丰富的蛋白质、膳食纤维、维生素等[1-2]。马蹄是广西产量较高的一种传统优势农产品，大多数企业将马蹄加工成“清水马蹄”罐头，其余鲜销马蹄占马蹄总产量的80%以上，但存在损坏率高、运输不方便等问题[3]。新鲜的马蹄在加工过程中会因机械伤造成的组织外露而导致褐变[4]，如能研究出一种马蹄抗性淀粉的生产方法，将极大提升马蹄的深加工水平，同时作为马蹄高值化的一个方向，将大幅促进贺州马蹄产业的发展。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）具有类似溶解性纤维的性质，能够起到与膳食纤维相似的功效，是膳食纤维很好的替代品，能够预防人们由于缺乏膳食纤维而导致的一系列疾病。它的主要生理功能有降血糖血脂、控制体重和抗癌，同时可改善人体肠道菌群结构[5]。吕明彧等[6]通过建立肥胖小鼠模型对小鼠进行多元复合抗性淀粉灌胃，发现多元复合抗性淀粉可以增强饱腹感使小鼠摄入食物量降低，可达到减肥降脂的效果。此外，抗性淀粉在棉花糖、巧克力等糖果的制造以及固体饮料的生产、面条的生产、糕点的生产中均有应用，可以调整产品的黏度，具有良好的保水性[7]。

抗性淀粉除了天然存在外，还可以通过对淀粉进行改性得到。根据其不同的来源和不同的抗酶解性能，可分物理包埋、老化回生和化学改性几种淀粉[8-9]。在制备抗性淀粉的方法中，物理方法改性和酶法改性由于所得产品相对安全[10]，现阶段研究人员较多，是国内外研究热点，但物理方法往往会对淀粉颗粒结构造成破坏。范会平等[11]对比了经过蒸制、老化、冷冻等处理后的全粉蒸煮损失率、微观结构、流变特性以及抗性淀粉含量变化，得出不同处理方法对全粉影响显著的结论。热处理时间过长将使抗性淀粉含量大幅降低，且伴随的压热处理等处理方式也会对能源产生极大的消耗，给环境带来一定的负担。化学法制备抗性淀粉所需要的温度较低，无须冷冻处理，相对节能、节时，具有极大的研究价值。牛博文等[12]对比了3 种化学方法制得的红薯抗性淀粉的酶解性、溶解性、持水性、膨润度、透明度、冻融性等指标，结果表明醚化淀粉各方面性质为最优。羧甲基醚化淀粉是醚化剂与淀粉中糖苷键或活性羟基在碱性的淀粉乳液条件下，发生取代反应得到的一种淀粉衍生物。彭丽等[13]以一氯乙酸为醚化剂，对大米淀粉进行改性，成功制得羧甲基醚化大米抗性淀粉，其产品具有良好的稳定性，各项理化性质均较优，由此可考虑以一氯乙酸作醚化剂，对马蹄抗性淀粉进行醚化处理。

本实验通过单因素试验和响应面设计优化羧甲基醚化法制备马蹄抗性淀粉的工艺参数，以期为羧甲基醚化法制备马蹄抗性淀粉提供理论依据及生产指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本文所用材料与试剂见表1。

表1 材料与试剂表

1.2 仪器与设备

本文使用的仪器与设备见表2。

表2 仪器与设备表

1.3 试验方法

1.3.1 马蹄抗性淀粉的制备

用与淀粉质量比为1.058 ∶1 的氢氧化钠和85%乙醇配制一定梯度质量分数的淀粉乳液，移入30 ℃恒温水浴锅中加热碱化60 min，加入一定量的一氯乙酸固体，搅拌均匀，设置一定的反应温度，醚化一定时间，反应结束后用盐酸滴定溶液pH 值至中性，用85%乙醇冲洗4 ～5 次至溶液中无氯离子，抽滤得到白色或淡黄色的固体或粉末，在45 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥24 h 以上，粉碎并过100 目筛，得到羧甲基醚化马蹄抗性淀粉与马蹄淀粉的混合物[14]。

1.3.2 马蹄抗性淀粉纯化

称量上述方法制得的马蹄抗性淀粉1 g于离心管中，将pH 值为6 的磷酸盐缓冲液按1 ∶12.5 的质量比加入离心管，振荡均匀后，加入0.2 mL（20 000 U·mL-1）的耐高温α-淀粉酶溶液，混匀，将离心管放进95 ℃的水浴恒温振荡器中水浴2 h，取出后冷却至室温，用4 mol·L-1柠檬酸溶液调节pH 值为4.6 ～4.8，加入1 mL（100 U·mL-1）糖化酶溶液，于60 ℃水浴恒温振荡器中水浴1.5 h，取出后冷却至室温，5 000 r·min-1离心5 min，取出后倒去上清液，将沉淀依次用95%、85%、75%的乙醇溶液洗涤4 ～5 次，将沉淀45 ℃干燥烘干24 h 以上，得到羧甲基醚化马蹄抗性淀粉[15-16]。

1.3.3 单因素试验

（1）淀粉乳液浓度对马蹄抗性淀粉得率的影响。选择5%、10%、15%、20%、25%、30% 6 种马蹄淀粉乳浓度，保持一氯乙酸与马蹄淀粉的质量比为1∶1（即醚化剂一氯乙酸用量占马蹄淀粉质量的100%，下同），设置醚化反应条件为温度40 ℃，醚化反应时间4 h。不改变其他条件，测定马蹄抗性淀粉的得率。

（2）醚化剂用量对马蹄抗性淀粉得率的影响。选择一氯乙酸与马蹄淀粉的质量比为1 ∶4、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1（即醚化剂一氯乙酸用量占马蹄淀粉质量的25%、50%、100%、200%、400%）这5 个不同的醚化剂用量，保持马蹄淀粉乳浓度为15%，设置醚化反应条件为温度40 ℃，醚化反应时间4 h。不改变其他条件，测定马蹄抗性淀粉的得率。

（3）醚化温度对马蹄抗性淀粉得率的影响。选择30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃ 6 个不同的醚化温度，保持马蹄淀粉乳浓度为15%，一氯乙酸与马蹄淀粉的质量比为1 ∶1，醚化时间为4 h。不改变其他条件，测定马蹄抗性淀粉的得率。

（4）醚化时间对马蹄抗性淀粉得率的影响。选择1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 5 个不同的醚化时间，保持马蹄淀粉乳浓度为15%，一氯乙酸与马蹄淀粉的质量比为1 ∶1，设置醚化温度为40 ℃。不改变其他条件，测定马蹄抗性淀粉的得率。

1.3.4 响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，参考Box-Behnken 设计原理，选择淀粉乳液浓度、一氯乙酸与马蹄淀粉的质量比、醚化温度作为研究因素，响应值设置为马蹄抗性淀粉得率，设计3 因素3 水平响应面试验。因素水平及相应编码设计情况见表3。

表3 因素水平及编码表

1.3.5 指标测定及表征

（1）马蹄抗性淀粉得率。单次试验纯化得到的羧甲基醚化马蹄抗性淀粉质量m1与单次试验所用到的马蹄淀粉质量m2的比值即为马蹄抗性淀粉得率。计算公式为

（2）感官分析。从醚化后性状、分离纯化后性状、块状物性状、干燥后产品质地几个方面对响应面试验过程中及结束后的产品性状进行比较。

（3）持水性。参考刘云芬等[17]的方法，分别称取马蹄抗性淀粉和马蹄淀粉1 g 溶解于10 mL 去离子水，计为m3，置于80 ℃水中，进行水浴加热30 min，冷却到室温后，13 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，称量离心管和沉淀重量计为m5[18]；离心管的重量计为m4。持水性计算公式为

（4）透明度。参考邵华为等[18]的方法，将样品配制成1%（m/V）的淀粉乳，沸水浴中加热搅拌30 min，充分糊化后，冷至室温，保持原体积。用1 cm比色皿于650 nm 波长下测定糊的透光率，以蒸馏水作为空白。

（5）扫描电镜。参考彭丽等[13]的方法，将样品提纯后，充分干燥，于扫描电镜下观察样品形态。

（6）红外光谱分析。参考相关研究[19-20]方法，将样品提纯后，充分干燥，将样品放入研钵中，加入干燥的光谱纯KBr 200 mg，混合研磨均匀（在红外灯下），使其粒度在2.5 μm 以下，装入压片模具，抽气压片，红外光谱仪分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 淀粉乳液浓度对马蹄抗性淀粉得率的影响

由图1 可知，当马蹄淀粉乳浓度为15%时，羧甲基醚化马蹄抗性淀粉得率最高，为38.27%；继续增大马蹄淀粉乳浓度，羧甲基醚化马蹄抗性淀粉得率呈下降趋势。羧甲基醚化马蹄抗性淀粉的形成与马蹄淀粉乳体系的浓度有关，当马蹄淀粉乳的浓度较低时，淀粉分子分离程度较大，有序结晶序列不易形成[21]。当马蹄淀粉乳的浓度较高时，不利于分子流动，亦将影响分子重排列和结晶[22]；试验中观察到，浓度过高的马蹄淀粉乳液难以混匀和分散，导致后期加入一氯乙酸后可能反应不完全，致使产品得率降低。

图1 淀粉乳浓度对抗性淀粉得率的影响图

2.1.2 醚化剂用量对马蹄抗性淀粉得率的影响

由图2 可知，在一氯乙酸与马蹄淀粉的质量比为1 ∶1（即一氯乙酸用量占马蹄淀粉质量的100%）时，马蹄抗性淀粉得率达到最高，为57.89%，随后呈现下降趋势。该试验结果说明，醚化剂用量并非越多越好，足量的醚化剂能使淀粉得到充分的反应，提高马蹄抗性淀粉的得率；而过量的一氯乙酸则无法继续提高马蹄抗性淀粉的得率，且会导致淀粉乳液整体偏酸性。羧甲基醚化淀粉是由淀粉与氯乙酸在碱性条件下发生双分子亲核取代反应制得，故酸性的乳液条件将不利于反应进行[23-25]。

图2 醚化剂用量对抗性淀粉得率的影响图

2.1.3 醚化温度对马蹄抗性淀粉得率的影响

由图3 可知，在醚化温度为40 ℃时，马蹄抗性淀粉得率最高，为62.38%；继续升高醚化温度，马蹄抗性淀粉得率基本呈下降趋势。原因是醚化温度如果过低，分子运动较慢，反应速度较慢，影响抗性淀粉的形成；醚化温度过高，溶液会形成胶黏结构，温度越高，胶黏越明显，越接近固态，不利于分子运动，不利于反应进行。此外，随醚化温度的升高，水分挥发流失较多，淀粉乳液浓度增大，也会使溶液越发黏稠。同时，副反应的发生亦不利于马蹄抗性淀粉的形成[26-29]。

图3 醚化温度对抗性淀粉得率的影响图

2.1.4 醚化时间对马蹄抗性淀粉得率的影响

由图4 可知，醚化时间为2 h 时马蹄抗性淀粉得率最高，为64.02%。初步判断醚化1 h 时反应不充分，故马蹄抗性淀粉得率较低。从整体上看，随时间的延长，马蹄抗性淀粉得率逐渐上升；但时间过长可能会使部分马蹄抗性淀粉遭到破坏，出现大分子降解等，导致马蹄抗性淀粉得率有所下降[30]。由于醚化时间的单因素试验数据呈波浪形，无法看出规律，而造成数据波动的原因亦尚未确定，无法判断最优，故不作为响应面优化中的自变量。

图4 醚化时间对抗性淀粉得率的影响图

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验结果与回归方程分析

响应面试验设计与结果如表4 所示。因素（A、B、C）和响应值（Y）之间的多元二次回归方程为

表4 响应面试验设计与结果表

由表5 可知，响应面试验设计的整体模型差异显著（P＜0.01），制备马蹄抗性淀粉的条件可预测得到。失拟项差异不显著（P=0.347 9 ＞0.05），表明二次回归模型与实际情况吻合良好，可靠性高，回归方程的拟合度较高。试验考察的3 个因素与响应值之间不是简单的线性关系，它们的相互改变对羧甲基醚化马蹄抗性淀粉的收率影响较大。A、B、C3 个因素对羧甲基醚化马蹄抗性淀粉得率的影响主次顺序为B＞C＞A，即醚化剂用量＞醚化温度＞淀粉乳液浓度。

表5 响应面试验方差分析表

2.2.2 最佳工艺参数确定与验证

采用Desigin-Expert 8.06 软件进行分析，得出羧甲基醚化马蹄抗性淀粉的最佳制备工艺条件为马蹄淀粉乳浓度12.26%，醚化剂用量117.92%（即一氯乙酸用量占马蹄淀粉质量的117.92%），醚化温度43.35 ℃，预测的最大得率为76.02%。为方便试验的开展，将所得试验参数调整为马蹄淀粉乳浓度12%，醚化剂用量120%，醚化温度43 ℃，进行3 次验证试验，取平均值，测得羧甲基醚化马蹄抗性淀粉的得率为75.85%，基本接近预测值76.02%，模型与实际情况拟合度较好，表明工艺设计可靠性较高，有效地对制备工艺进行了优化。

2.3 感官分析

如表6 所示，醚化温度为50 ℃的试验组在醚化完成后均呈较硬的质地（试验号2、5、10、11）；一氯乙酸用量150%的试验组制得的抗性淀粉在分离纯化后大多呈絮状（试验号6、9、11、14），一氯乙酸用量50%的试验组醚化后多成沙状，未形成胶黏结构，几乎无抗性淀粉生成，或制得量较低（试验号1、10、12、15），产品性状的差异可能是造成羧甲基醚化马蹄抗性淀粉得率差异的因素之一。用羧甲基醚化法制得的马蹄抗性淀粉产品均为胶质，紧紧贴合于干燥时所用的容器上，持水性较好，干燥时间长。

表6 响应面试验过程中产品性状比较表

2.4 理化指标测定与表征分析

2.4.1 持水性、透明度测定

由表7 可知，上述最优工艺下制得的羧甲基醚化马蹄抗性淀粉的持水性优于原马蹄淀粉，可能是因为羧甲基醚化淀粉引入了亲水性的羧甲基基团[31]。马蹄抗性淀粉的透明度也优于原马蹄淀粉，这是因为亲水基团的引入会阻碍分子缔合而减弱光的反射与折射；分子膨胀亦会使淀粉分子体积增大，使光的透过率有所提高[32]。

表7 原淀粉与马蹄抗性淀粉持水性、透明度比较表

2.4.2 扫描电镜分析

从图5可以看出，原马蹄淀粉颗粒较小，多为圆形，呈规律的颗粒状，表面光滑；羧甲基醚化淀粉形貌遭到破坏，分子表面有些许凹陷和裂痕，颗粒较大，形状不规则且存在粘连，颗粒表面有大量细小颗粒附着。由此可知，羧甲基醚化法会对淀粉颗粒的结构造成破坏和腐蚀，小颗粒的成分可能是被破坏后的淀粉小颗粒和一氯乙酸、氢氧化钠颗粒[12]。

图5 原淀粉与醚化淀粉形态观察图

2.4.3 红外光谱分析

本试验参考文献[14]选取4 000 ～1 000 cm-1图谱进行分析。由图6 可知，原马蹄淀粉在3 356 cm-1出现的峰是缔合-OH 的伸缩振动峰，在2 931 cm-1出现的峰是C-H 非对称伸缩振动吸收峰，在1 650 cm-1出现淀粉所吸收水分子的2个-OH剪切形成的吸收峰，在1 158 cm-1出现C-O-C 非对称伸缩振动吸收峰，在1 018 cm-1出现C-(OH)对称振动吸收峰，在929 cm-1、861 cm-1、764 cm-1、577 cm-1出现的峰是糖环伸缩振动吸收峰[33]。与原马蹄淀粉图谱相比，羧甲基醚化淀粉在1 590 cm-1、1 413 cm-1和1 320 cm-1出现明显的吸收峰，为羧酸盐-COO-的对称和非对称的收缩振动峰，可以证明原马蹄淀粉中的-OH 已被羧甲基取代，羧基已经接入马蹄淀粉的分子链中[14,30]。

图6 原淀粉与醚化淀粉红外图谱

3 结论

本文以马蹄淀粉为原料，采用羧甲基醚化法制备马蹄抗性淀粉，并通过单因素试验和响应面法进行工艺优化。在单因素试验中，马蹄淀粉乳浓度、醚化剂用量和醚化温度对羧甲基醚化马蹄抗性淀粉得率均存在明显影响，而醚化时间的影响趋势呈波浪形，综合考虑后，选择马蹄淀粉乳浓度、醚化剂用量、醚化温度进行响应面试验。最终得到的最佳工艺条件为马蹄淀粉乳浓度12.26%，醚化剂用量117.92%，醚化温度43.35 ℃。为方便实验开展，调整马蹄淀粉乳浓度为12%，醚化剂用量为120%，醚化温度为43 ℃，该工艺下马蹄抗性淀粉得率为75.85%，与预测值76.02%接近，表明实验结果可靠，可为工业化生产提供了理论参考。羧甲基醚化法制得的马蹄抗性淀粉质地胶黏、持水度高、工艺简单，且得率较高，生产成本较低，制得产品可用作增稠剂、涂膜剂等，用途广泛。