山楂多糖酶解法和水提法的工艺优化和比较

◎ 刘 京，李荣乔，张胜楠，李 成，马 军

（石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050000）

山楂为蔷薇科植物，在我国河北、山东、江西、辽宁等地均有广泛种植，被列为主要树种之一[1-2]。山楂，性味微酸、甘，微温，入脾、胃、肝经，具有消食积、行瘀、化滞等功效[3]。山楂是一种药食同源的植物，近年来广泛应用于营养功能食品的开发。

糖是由多个单糖分子缩合、失水，并由糖苷键连接而成的高分子碳水化合物，与蛋白质、核苷酸被称作是维持生命活动的三大物质，也是中药材的主要活性成分之一。多糖具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌和提高免疫力等多种生物活性，而且使用安全、不良反应少，被认为是药品和食品开发与利用的理想原料[4-5]。

多糖的提取方法有很多，包括水提法[6]、酶解提取法[7]、酸碱提取法[8-9]、超声提取法[10]和微波提取法[11]等。为实现多糖提取的工业化生产，考虑到酸碱提法易腐蚀提取管道，超声提取法和微波提取法的试验条件不易实现放大化，本试验选择水提法和酶解提取法进行条件优化并对比，以多糖含量为指标，采用苯酚-硫酸分光光度法进行含量检测，最终筛选出提取山楂多糖的最适条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂片，河北蔺氏盛泰药业有限公司；无水葡萄糖对照品，中国食品药品检定研究院；果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶，夏盛生物技术有限公司；苯酚、硫酸、无水乙醇，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（QUINTIX2102-1CN），赛多利斯；电热恒温水浴锅（DK-S26），上海精宏实验设备有限公司；超声波清洗器（KQ-700VDE），昆山舒美；离心机（X-15R），美国贝克曼公司；紫外可见分光光度计（Evolution 201），美国Thermo 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将山楂片置于40 ℃烘箱内恒温干燥4 h，烘干后粉碎，将所得粉末状样品低温密闭保存备用。

1.3.2 山楂多糖酶解提取法的单因素试验

（1）酶种类的筛选。称取4 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入纯水，分别加入5‰的果胶酶、5‰的纤维素酶、5‰的半纤维素酶、5‰的木瓜蛋白酶，调节至各酶适合的pH 值，50 ℃水浴酶解1.0 h，反应结束后100 ℃沸水灭活10 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行多糖含量的测定。

（2）酶用量的优化。称取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入纯水，分别加入1‰、3‰、5‰、7‰和9‰的木瓜蛋白酶，调节至pH=7，50 ℃水浴酶解1.0 h，反应结束后100 ℃沸水灭活10 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行多糖含量的测定。

（3）酶解时间的优化。称取4 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入纯水，加入7‰的木瓜蛋白酶，调节至pH=7，50 ℃水浴，分别酶解0 h、1.0 h、1.5 h 和2.0 h，反应结束后100 ℃沸水灭活10 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行多糖含量的测定。

（4）酶解pH 值的优化。称取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入纯水，加入7‰的木瓜蛋白酶，分别调节至pH=5、6、7、8 和9，50℃水浴酶解1.0 h，反应结束后100 ℃沸水灭活10 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行多糖含量的测定。

（5）酶解温度的优化。称取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）加入纯水，加入7‰的木瓜蛋白酶，调节至pH=8，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃水浴酶解1.0 h，反应结束后100 ℃沸水灭活10 min，4 000 r·min-1离心10min，取上清液进行多糖含量的测定。

（6）酶解料液比的优化。称取5 份山楂粉末各10 g，按照料液比1 ∶10（g ∶mL）、1 ∶15（g ∶mL）、1 ∶20（g ∶mL）、1 ∶25（g ∶mL）和1 ∶30（g ∶mL）加入纯水，加入7‰的木瓜蛋白酶，调节至pH=8，40 ℃水浴酶解1.0 h，反应结束后100 ℃沸水灭活10 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行多糖含量的测定。

1.3.3 山楂多糖酶解提取法的正交试验

根据单因素实验结果选择影响较大的因素和水平，以酶用量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）、酶解pH 值（D）为考察因素，以多糖提取率为考察指标，设计正交试验因素水平表（表1）。

表1 酶解法正交试验因素水平表

1.3.4 山楂多糖水提法的正交试验

由于水提法的影响因素较少，直接进行正交实验。以提取次数（A）、提取时间（B）、料液比（C）为考察因素，以多糖提取率为评价指标，正交试验因素水平见表2。

表2 水提正交试验设计因素水平表

1.3.5 多糖含量的测定

（1）沉淀多糖。准确吸取样品液5.0 mL 于离心管中，加入无水乙醇20 mL，混匀后置于冰箱过夜。取出样品于离心机4 000 r·min-1离心10min，倒出上清液，残渣用80%乙醇溶液洗涤，再离心10 min，倒出上清液，反复操作3 次。最后将残渣用水溶解定容至50 mL。

（2）标准曲线的绘制。称取无水葡萄糖对照品50 mg 于50 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，得对照品母液。准确吸取对照品母液0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL 和2.00 mL 于25 mL 比色管中，依次用水补足至2.0mL，加入1.0 mL 苯酚溶液和10 mL 浓硫酸，沸水浴2 min，冷却至室温，用分光光度计设置485nm 波长，依次测定样品吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

所得线性回归方程为y=0.005+0.005x，相关系数r2=0.997。

（3）样品测定。依次吸取各样品液2.0 mL 按上述方法测定吸光值，计算多糖提取率。

（4）结果计算。多糖提取率的计算公式为

式中：X为多糖提取率，%；m1为样品液中葡萄糖含量，g；V1为样品液总体积，mL；V2为沉淀多糖所用样品液体积，mL；m2为样品质量，g；0.9为葡萄糖换算为多糖的系数。

1.4 数据统计与分析

每个实验组设3 个平行，计算样品中多糖含量，正交试验设计和结果采用正交设计助手专业版V 3.1进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 山楂多糖酶解提取法单因素试验结果

2.1.1 酶种类的优化

酶种类对多糖提取率的影响见图1。木瓜蛋白酶的多糖提取率最高，为5.8%，所以选择木瓜蛋白酶作为提取酶。

图1 酶种类对多糖提取率的影响图

2.1.2 酶用量的优化

酶用量对多糖提取率的影响见图2。随着酶用量的增加，多糖提取率逐渐升高，当酶量超过7‰时，增加不明显，可能是由于酶的用量会影响酶的水解程度[12]。考虑到成本，确定最佳酶用量为7‰。

图2 酶用量对多糖提取率的影响图

2.1.3 酶解时间的优化

酶解时间对多糖提取率的影响见图3。酶解1.0 h后多糖提取率的变化不明显，可能是由于1.0 h 时底物已与酶完全反应，所以选择1.0 h 作为最佳酶解时间。

图3 酶解时间对多糖提取率的影响图

2.1.4 酶解pH 值的优化

酶解pH 值对多糖提取率的影响见图4。随着pH值的升高，多糖提取率呈先升高后降低的变化趋势。当pH 值为8 时，提取率达到最大值11.5%，但当进一步提高pH 值时，提取率明显下降，说明pH 值过高或过低均会抑制酶的活性。因此，确定最佳pH 值为8。

图4 酶解pH 值对多糖提取率的影响图

2.1.5 酶解温度的优化

酶解温度对多糖提取率的影响见图5。随着酶解温度的提高，多糖提取率呈先升高后降低的趋势。当酶解温度为40 ℃时，多糖提取率最高，为10.06%；随着酶解温度的进一步升高，提取率开始下降，可能是由于酶在最佳温度时活性最高，而高温则使酶失活。因此，选择40 ℃作为最佳酶解温度。

图5 酶解温度对多糖提取率的影响图

2.1.6 酶解料液比的优化

料液比对多糖提取率的影响见图6，料液比对多糖提取率无明显影响，为节约实际生产成本，确定最佳料液比为1 ∶10（g ∶mL）。

图6 料液比对多糖提取率的影响图

2.2 山楂多糖酶解提取法正交试验结果

由表3 可知，根据k值得到酶解法提取山楂多糖的最佳工艺为A1B2C1D3，即酶用量3‰、酶解温度50 ℃、酶解时间1.0 h、酶解pH=8；根据多糖提取率最高值得到酶解法提取山楂多糖的最佳工艺为A3B2C1D3，即酶用量7‰、酶解温度50℃、酶解时间1.0 h、酶解pH=8。由表4 可知，酶解时间（C）与酶解pH（D）对多糖提取率有显著影响（P＜0.05），而酶用量和酶解温度对多糖提取率无显著影响。考虑到实际生产成本，选定A1B2C1D3为酶解法提取山楂多糖的最佳工艺。

表3 酶解法正交试验结果表

2.3 山楂多糖水提法正交试验结果

水提法正交试验结果见表5，根据k值得到水提法提取山楂多糖的最佳工艺为A3B3C3，即提取次数3 次、提取时间120 min、料液比1 ∶12；根据多糖提取率最高值得到水提法提取山楂多糖的最佳工艺为A3B3C2，即提取次数3 次、提取时间120 min、料液比1 ∶10。由表6 可知，提取次数（A）对多糖提取率有显著影响（P＜0.05），而提取时间（B）与料液比（C）对多糖提取率无显著影响。考虑到实际生产成本，选定A3B3C2为水提法提取山楂多糖的最佳工艺。

表5 水提法正交试验结果表

表6 水提法正交试验方差分析表

2.4 酶解与水提工艺的对比

为确定山楂多糖的最终提取工艺，并考虑到试验中可能出现的误差以及实际节能减排的生产情况，在正交试验结果的基础上，选定酶解法最佳工艺和水提法最佳工艺进行验证对比实验，重复3 次，对比结果如表7 所示。酶解法提取率高于水提法，酶解工艺优于水提工艺，所以选定酶解工艺作为山楂多糖的最终提取工艺。

表7 酶解法与水提法工艺对比分析表

3 结论

植物多糖在自然界中广泛存在，是许多药物和食品中的功能成分，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降血糖等多种生物学功能。对多糖的生物活性研究是当前天然成分研究的热点之一[13]。有关山楂多糖提取的研究国内外报道较少，本文对比了酶解法和水提法对山楂多糖提取率的影响，得出酶解最佳工艺为酶用量3‰、酶解温度50 ℃、酶解时间1.0 h、酶解pH=8、料液比1 ∶10、多糖提取率为11.72%；水提最佳工艺为提取次数3 次、提取时间120 min、料液比1 ∶10，多糖提取率为9.47%。并通过对比得出酶解工艺优于水提工艺，此工艺方法简便，实用性强，以期为工业化生产提供依据。