流动相组分及比例对苯甲酸、山梨酸、糖精钠保留时间的影响

□ 胡 月 王志富 公安县公共检验检测中心

苯甲酸、山梨酸、糖精钠是食品中较为常见的食品添加剂，也是食品检验中的常规检测项目。按照GB5009.28—2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[1]国家标准方法的条件进行测定，检测效率并不能达到最优，需根据实际情况进行调整。通过添加不同的缓冲盐[2]或者梯度洗脱[3，4]的方式对这3种添加剂以及更多组分进行同时测定的文献有很多。本实验在国家标准GB 5009.28—2016的基础上，探讨流动相组分及比例对这3种添加剂保留时间的影响，以提高日常检测效率，为相关检测提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

苯甲酸、山梨酸、二水糖精钠标准物质1 mg/mL：坛墨质检；甲醇（色谱纯）：J.T.Baker；乙酸铵（色谱纯）：C.N.W；甲酸（色谱纯）：J.T.Baker；超纯水。

高效液相色谱仪：Waters e2695，配2489紫外检测器；超声波清洗机：宁波新芝 SB25—12DTD。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters symmetry C18色谱柱，（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm；流动相1：不同体积比的甲醇和0.02 mol/L乙酸铵溶液；流动相2：不同体积比的甲醇和甲酸—乙酸铵溶液（2 mmol/L甲酸+0.02 mol/L乙酸铵）；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL。

1.3 标准溶液的配制

分别准确移取1 mL上述3种标准品于10 mL容量瓶中，超纯水定容，配制成100 μg/mL的3种标准储备液，临用前用超纯水稀释成10 μg/mL的混合标准工作液。

2 结果与讨论

2.1 流动相为不同体积比的甲醇和乙酸铵溶液

按照国家标准GB 5009.28—2016中甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液比例为5∶95时，按1.2中的色谱条件进行分析，3种物质分离效果比较好，但出峰时间较长，分别为苯甲酸9.018 min、山梨酸11.225 min、糖精钠 15.246 min（图 1）。

当样品量较大时，在该流动相比例条件下检测效率较低，故分析了不同体积比的甲醇和乙酸铵溶液对3种物质的保留时间影响。结果显示，随着甲醇比例的提高，3种物质的保留时间不断前移。甲醇比例在7%～10%时，山梨酸和糖精钠的保留时间比较接近甚至无法分离；甲醇比例提高到10%以上时，3种物质的出峰顺序有所改变，其中糖精钠的出峰顺序移至山梨酸之前；甲醇比例在12%和13%时分离效果比较好，其中甲醇与乙酸铵溶液比例为12∶88时，保留时间分别为苯甲酸6.292 min、糖精钠7.394 min、山梨酸8.520 min（图2）。当甲醇比例提高到15%时，苯甲酸和糖精钠的保留时间比较接近，分离效果不理想（图3）。

2.2 流动相为不同体积比的甲醇和甲酸-乙酸铵溶液

国家标准GB 5009.28—2016中提到，当样品中基质较为复杂，存在干扰峰时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，故本实验也研究了流动相中加入甲酸后对3种物质保留时间的影响。

图1 甲醇与0.02 mol/L乙酸铵比例为5∶95时的标准样品色谱图

图2 甲醇与乙酸铵比例为12∶88时的标准样品色谱图

图3 甲醇与乙酸铵比例为15∶85的标准样品色谱图

实验结果显示，甲醇比例为5%时，3种物质的分离效果较好，其中山梨酸出峰最慢，保留时间较长，分别为苯甲酸12.516 min、糖精钠15.151 min、山梨酸 23.124 min（图 4）。

图4 甲醇与甲酸-乙酸铵比例为5∶95的标准样品色谱图

当甲醇比例提高至10%以上时，糖精钠最先出峰，甲醇比例接近10%为15∶85时，分离效果较好，保留时间分别为糖精钠5.317 min、苯时，糖精钠和苯甲酸分离效果不好，甚至出峰时间重叠（图5）。

图5 甲醇与甲酸-乙酸铵比例为10∶90时的标准样品色谱图

当甲醇与甲酸—乙酸铵溶液比例甲酸6.418 min、山梨酸10.122 min（图 6）。

图6 甲醇与甲酸-乙酸铵比例为15∶85的标准样品色谱图

3 结论

流动相中未加甲酸时，随着甲醇比例的提高，3种组分的出峰顺序会由苯甲酸、山梨酸、糖精钠变化为苯甲酸、糖精钠、山梨酸，且甲醇与乙酸铵溶液体积比为12%～13%时，分离效果良好；流动相中加入甲酸时，甲醇比例提高后，出峰顺序由苯甲酸、糖精钠、山梨酸变化成糖精钠、苯甲酸、山梨酸，且甲醇与甲酸—乙酸铵溶液体积比为15∶85时，分离效果较好。