基于片段生长技术的PD-1/PD-L1小分子抑制剂的设计

赵东升，程铖，廖伟科*（1.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；.贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心，贵阳 550004）

肿瘤细胞在遗传性以及表观遗传性方面与正常细胞差异显著，能够被免疫系统有效识别并清除，但肿瘤细胞会运用不同的方式来避开免疫系统的监视。当免疫检查点分子过度表达或功能过强时，免疫功能将会受到抑制[1]，从而发生“免疫逃逸”的现象，加速肿瘤生长[2]。阻断免疫检查点分子的信号传导成为治疗肿瘤的常用方法，其中程序性细胞死亡受体1（PD-1）/程序性细胞死亡-配体1（PD-L1）通路是免疫检查点中最具临床价值的靶标之一[3]。PD-1又叫CD279，是一种由272个氨基酸组成的跨膜蛋白[4]。PD-L1又叫CD274，是一种由290个氨基酸组成的跨膜蛋白[5]。PD-1和PD-L1的结合可以抑制T细胞的活性，减少自身免疫反应，防止免疫系统过度反应。在某些情况下，肿瘤细胞会利用这种机制来逃避免疫监视，发生免疫逃逸从而促进肿瘤的生长和扩散[6]。随着小分子与PD-1/PD-L1晶体复合物的解析，研究者们对于PD-1/PD-L1小分子抑制剂的开发也迎来蓬勃的发展阶段，但是目前报道的小分子抑制剂均为联苯母核结构，且现有化合物临床试验最高阶段仍处于Ⅰ期临床。因此，开发出结构多样性且安全有效的PD-1/PD-L1小分子抑制剂具有十分重要的意义。

药物的从头设计是一种不仅可以提出新型化学结构，并且能够满足所需靶点结构特征的方法，这一方法随着计算机辅助药物设计的发展也逐渐受到众多药物化学家们的青睐[7]。相比虚拟筛选，药物的从头设计可以在分子片段生成的方式上寻找到特定性质的全新结构分子，在保留原有片段的基础上实现分子结构多样性[8]。此前有报道几种包含苯甲酰苯胺骨架的新型小分子，如图1所示，这类分子不仅具有新颖的骨架结构，也表现出良好的体内外抑瘤活性[9-11]。为了保持新型的苯甲酰苯胺linker，本研究采用片段生长的从头设计方法，以苯甲酰苯胺作为初始片段，将FDA化合物库拆分为碎片，并在初始片段各位点迭代生长，进一步将这一包含苯甲酰苯胺的数据库作为对接筛选的对象，以期获取潜在的PD-1/PD-L1小分子抑制剂。

图1 4种苯甲酰苯胺骨架化合物Fig 1 Four benzanilide skeleton compound

1 材料与方法

1.1 平台与软件

本研究所有计算内容均在北京并行超级计算中心平台完成。

MolAICal软件用于片段库的准备和片段生长[12]；AutoDock Vina软件用于分子对接；AutoDock Tools软件用来重置蛋白力场及原子类型；Pymol软件用来进行可视化结果分析[13]；Amber16软件用来执行分子动力学模拟；Open Babel软件用来作为格式间转换。

1.2 数据库准备

从RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）蛋白数据库获取PD-L1蛋白（PDB ID：6r3k），使用AutoDock Tools程序对其添加极性氢并合并非极性氢，删除A、B两条链并删除水和溶剂分子，保存为pdbqt格式作为片段生长和分子对接的蛋白受体。从FDA官网获取FDA分子库，使用Open Babel软件将其转换为smi格式并打碎为片段，建立FDA碎片库。

1.3 片段生长

使用AutoDock Vina将苯甲酰胺片段对接进入PD-L1蛋白中，确定其初始构象，将其各含氢键的原子定义为生长位点，以FDA碎片库作为生长来源，生长范围设定为30 Å×30 Å×30 Å，允许产生的新分子被迭代并且迭代次数为10。在迭代过程中，合成可行性较低的分子和相对分子量低于300、高于1000的分子即舍弃。产生的新分子根据打分进行排序。

1.4 分子对接筛选

将片段生长建立的分子库作为筛选的来源，PD-L1二聚体作为受体蛋白，每个小分子生成10个构象，exhaustiveness设置为8，结合位点坐标为x＝-7.118，y＝59.347，z＝-19.516。使用AutoDock Vina提交作业，保留打分靠前的分子。

1.5 分子动力学模拟

将分子对接的结果作为分子动力学模拟的初始构象。然后对所有备选分子施加氢原子并进行去质子化。将小分子用Amber软件中的antechamber程序施加bcc电荷和gaff2力场，并使用parmchk程序检查该小分子是否还需要辅助力场参数。创建一个距离蛋白质10 Å的溶剂立方体盒（cubic box），盒内填充tip3p水模型，向配体-受体-溶剂体系中添加4个钠离子以保持电中性。通过周期性边界条件（PBC）消除边界效应。使各种组分的能量最优化，其中蛋白质、配体和抗衡离子的限制电位受到419 kJ/molÅ2的力常数约束，水分子能级分布通过系统最小化调整以稳定其状态，同时进一步最小化系统能量，蛋白和配体均成为另一组419 kJ/molÅ2的力常数所约束。蛋白的骨架设有83.8 kJ/molÅ2的力常数限制，并且只允许侧链在进行能量最小化时放松。释放整个系统受到的限制并最大程度地降低其能量。体系能量优化之后，在200 ps的等温和等压条件下，从10 K加热到300 K，并在400 ps的平衡状态模拟过程中进行NPT系综：等温等压系综模拟。最后约束与氢原子相连的化学键并进行动力学模拟，模拟积分步长设定为2 fs。

1.6 MM/GBSA结合自由能计算

结合自由能和每个残基的分解自由能用Amber16中镶嵌的MM/GBSA.py脚本计算。在MM/GBSA方法中，配体与蛋白质受体结合形成络合物的自由能可以用以下公式表示[14-15]：

ΔGbind＝ΔGcomplex-ΔGreceptor-ΔGligand＝ΔEinternal＋ΔEVDW＋ΔEelec＋ΔGGB＋ΔGSA

其中，ΔEVDW表示范德华相互作用，ΔEinternal表示内能，ΔEelec表示静电作用，ΔGGB和ΔGSA表示溶剂化自由能和非极性溶剂自由能。

1.7 PD-1/PD-L1阻断实验

通过均相时间分辨荧光（HTRF）实验进一步测定受试化合物的IC50值。使用PD-1/PD-L1试剂盒（Cisbio公司），根据说明书操作：将抑制剂在二甲基亚砜（DMSO）中稀释，然后用缓冲液连续稀释到特定的浓度梯度（2.4～120 000 nmol·L-1），在12孔板上各加2 µL缓冲液，再加入4 µL Tag1-Pd-L1溶液、4 µL Tag2-Pd-1。在室温下孵育15 min后，加入10 µL的anti-Tag1-Eu3＋和anti-Tag2-XL665。将板密封并在室温下孵育2 h，用Envision读取测试孔的信号值[16]。

2 结果与讨论

2.1 片段生长

本研究的工作流程如图2所示，以苯甲酰胺的初始片段经过迭代后获取了3891个分子，依据各分子与结合口袋的相互作用以及合成可行性保留排名前1000的分子进一步作为虚拟筛选的数据库来源；经过AutoDock Vina对接打分后，保留打分最高的前8个分子（结构如图3所示，打分如表1所示），参照结合模式最终选取3个分子进行分子动力学模拟并计算其MM/GBSA结合自由能，最终购买一个分子进行体外活性验证。

表1 8个化合物对接打分(kJ·mol-1)Tab 1 Docking scoring of 8 compounds (kJ·mol-1)

图2 抑制剂的发现流程Fig 2 Discovery process of inhibitors

图3 8个候选化合物结构Fig 3 Structure of 8 candidate compounds

2.2 结合模式分析

8个候选分子的结合模式如图4所示。其中776191、J170、123641这3个具有更突出的结合模式。776191分子表现出最高的打分结果为-50.996 kJ·mol-1，并且与PD-L1形成非常丰富的氢键作用。可以看出，该分子与PD-L1二聚体蛋白C链上的66位谷氨酰胺，121位丙氨酸，D链上125位的精氨酸，123位的苏氨酸，19位的苯丙氨酸，121位的丙氨酸，115位的甲硫氨酸共形成九根氢键相互作用，这些氢键将776191分子铆定在PD-L1二聚体蛋白构成的结合口袋里，展示了良好的结合作用。J170分子不仅与PD-L1蛋白C链的56位酪氨酸形成π-π堆积作用，还与C链的115位甲硫氨酸，121位丙氨酸，123位酪氨酸，D链的20位酪氨酸，54位异亮氨酸，56位酪氨酸，121位丙氨酸，123位酪氨酸形成疏水作用力，这些范德华作用驱动J170更倾向进入到蛋白的疏水空腔。123641分子与PD-L1蛋白也拥有良好的疏水作用，并且还与C链的56位酪氨酸，122位天冬氨酸，D链的123位酪氨酸，125位精氨酸形成氢键作用，此外123641还与C链的56位酪氨酸形成π-π堆积作用。

图4 8个分子的结合模式Fig 4 Binding mode of 8 molecules

2.3 结合自由能计算

为了更精确地了解776191、J170、123641这3个分子的能量表现，本研究对其进行了MM/GBSA的自由能计算，能量越低说明小分子与蛋白的复合物体系结合越强，结果如表2所示。可见776191表现出最低的结合自由能为-271.831 kJ·mol-1，其中范德华作用占据主导作用力为-362.720 kJ·mol-1，此外还具有-123.165 kJ·mol-1静电作用提供的能量。在J170和123641两个分子上同样也是范德华占据主导作用，静电作用力为次要作用，而极性溶剂化作用则大大地阻碍了复合物的结合。这一结果证明3个分子均是在疏水作用驱动下与PD-L1蛋白发生紧密结合。

表2 3个化合物的结合自由能(kJ·mol-1)Tab 2 Binding free energy of 3 compounds (kJ·mol-1)

2.4 分子动力学轨迹分析

由于776191具有较高的结合自由能，将其作为研究对象进行动力学轨迹分析。如图5所示，绿色代表776191分子，红色代表受体蛋白PDL1，黑色代表776191-PD-L1复合物体系。可以看出，在为期100 ns时长的生理环境模拟过程中，776191小分子表现出一定的波动，但波动幅度维持在3 Å左右，相对比于PD-L1受体蛋白可以看出，小分子的加入并未引起蛋白本身发生较大的波动。鉴于776191分子本身的结构特征，其包含较多的可旋转键，不可避免地在运动过程中某些时刻发生键角的扭转。因此可以认为776191分子在模拟的运动过程中维持着一定的平稳性。

2.5 PD-1/PD-L1阻断实验

经过上述实验最终确定了776191分子是最具有潜力的PD-L1小分子抑制剂，进一步通过HTRF实验测定其体外PD-1/PD-L1抑制活性，如图6所示，776191表现出中等的抑制活性，IC50为92 μmol·L-1。

图6 HTRF法测定化合物776191的IC50Fig 6 IC50 determination of compound 776191 based HTRF assay

3 讨论

PD-L1小分子抑制剂结构多样性的缺乏始终是阻碍其临床发展的一大挑战。本项研究通过确立一个新颖的苯甲酰苯胺片段，使用从头设计的思路和片段生长的方法最终确证776191分子是一个具有一定PD-L1抑制活性的小分子抑制剂。

776191具有新颖的骨架结构，然而其IC50为92 μmol·L-1的表现并没有非常出色，这可能是由于以下原因引起：① 776191分子具有较多的氢键受体和可旋转键，这可能造成极性溶剂对其结合能表现出214.702 kJ·mol-1的抑制作用；② 776191的溶解性存在一定的不足，这可能是影响其活性表现的直接原因。鉴于上述两种原因，对776191在结构上进一步精简优化将可能获得活性更加良好的分子，本研究为改造安全有效的PD-1/PD-L1小分子抑制剂奠定了理论基础。