基于GC-TOF-MS和UHPLC-QE-MS的苏合香化学成分分析

牟菲，张倩，蔺瑞，赵美娜，陶星茹，赵瑾怡，汤海峰，王婧雯*（.空军军医大学第一附属医院药剂科，西安 7003；.空军军医大学药学系，西安 7003）

苏合香（styrax；storax；Suhexiang）是从金缕梅科植物苏合香树（LiquidambarorientalisMill.）的树干渗出并精制而成的一种香树脂，具有“温通心脉”之功效，相关方剂治疗冠心病临床疗效确切、应用广泛[1-4]。苏合香作为树脂和油状液体混合物，化学成分十分复杂，目前仅靠单一指标性成分鉴定很难全面反映苏合香的内在质量差异。因此，全面分析苏合香化学成分对于苏合香药效物质的筛选及其二次开发具有重要意义。

中药多维度数据的分析和利用成为新的掣肘问题，质谱联用技术以其高分辨率、高分离性和高灵敏度等优势著称，使用该技术，无需参照标准物质，即可精确地表征中药中含有的化合物的结构，包括精确质量数、元素组成和质谱碎片信息等，现已被广泛应用于中药化学成分鉴定[5-7]。因此，本研究首次采用GC-TOF-MS结合UHPLC-QE-MS的分析方法对苏合香化学成分进行初步定性分析，以期为苏合香防治疾病的药效物质筛选提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890B气相色谱-LECO PEGASUS HT质谱仪联用系统（Agilent）； Vanquish UHPLC-Q Exactive HFX质谱联用仪系统（Thermo）；涡旋仪（江苏其林贝尔公司）；超纯水机（德国默克密理博Milli-Q）；电子分析天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

肉桂酸肉桂酯、4-羟基肉桂酸对照品（上海易恩化学技术有限公司），肉桂酸苄酯、肉桂醛对照品（北京百灵威科技有限公司），肉桂酸对照品（中国食品药品检定研究院），上述对照品批号分别为R020240、R006198、JK508307、JK188151、110786，含量均大于 98%，均于 4℃冷藏备用。

色谱纯甲醇和乙腈（德国CNW Technologies公司）、色谱纯乙酸铵（美国Sigma-Aldrich公司）、乙酸（美国Fisher Chemical公司）、超纯水（电阻率为18.25 MΩ）由超纯水机系统制备；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 GC-TOF-MS法测定苏合香挥发性成分

2.1.1 供试品溶液制备 精密称取苏合香提取物1 g置5 mL EP管中，并加入3 mL预冷甲醇冰水浴超声10 min，静置后将供试品溶液4℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清液置进样瓶中待测。

2.1.2 检测条件 Agilent 7890B气相色谱-LECO PEGASUS HT质谱仪联用系统，毛细管柱为Agilent DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm，J&W Scientific，Folsom，USA），GC-TOF-MS具体参数设置见表1。

表1 GC-TOF-MS上机检测参数设定Tab 1 Detection parameter of GC-TOF-MS

2.1.3 数据分析 使用LECO公司的Chroma TOF工作站软件（Version 4.3x）和NIST数据库（https：//www.nist.gov/index.html）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐、质谱匹配等分析确定苏合香中的化学成分，并通过面积归一化法计算各化学成分在苏合香中的相对百分含量。

2.1.4 成分识别 采用GC-TOF-MS质谱联用仪进行分离分析，得到苏合香成分质谱总离子流图，如图1所示。以面积归一化法测定各成分相对百分含量，经Chroma TOF软件和NIST库对质谱数据进行检索对比，并结合标准质谱图鉴定化学成分，按照目标物与标准物的相似度达 80%，初步鉴定出苏合香提取物中 25个挥发性成分，占苏合香提取物色谱峰总面积的97.7%，主要成分有肉桂酸肉桂酯（29.46%）、肉桂醇（11.17%）、肉桂酸苄酯（8.83%）、苯甲酸肉桂酯（6.69%）、β-石竹烯（2.47%）、肉桂醛（2.02%）和苯乙烯（0.77%）等，具体成分及其相对含量结果如表2所示。

图1 苏合香 GC-TOF-MS 总离子流图Fig 1 Total ion chromatogram of styrax based on GC-TOF-MS

表2 苏合香的挥发性成分及其相对含量Tab 2 Volatile components of styrax and their relative mass fractions

2.2 UHPLC-QE-MS法测定苏合香可溶性成分

2.2.1 供试品溶液制备 精密称取苏合香提取物1 g，加入3 mL甲醇，过0.45 μm滤膜，样品稀释至50 mg·mL-1上机检测；每个对照品称取10 mg，用甲醇定容到1 mL，得到10 mg·mL-1对照品溶液，过0.45 μm滤膜后取等体积混合，混标稀释1000倍上机检测。

2.2.2 检测条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；质谱仪为Thermo Q Exactive HFX，一级、二级质谱数据采集为Xcalibur（Thermo Fisher Scientific，USA）；UHPLC-QE-MS具体参数设置见表3。

表3 UHPLC-QE-MS上机检测参数设定Tab 3 Detection parameter of UHPLC-QE-MS

2.2.3 数据分析 使用ProteoWizard软件，将原始数据转成mzXML格式后，然后进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，将收集到的苏合香的化合物名称、分子式、加合离子、m/z值、一级和二级质谱碎片等信息，导入自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。MS2score为二级质谱匹配定性打分值，取值范围为0～1，越接近于1，代表匹配结果可信度越高。对于有对照品的化合物，将此化合物与对照品的色谱保留时间tR和一级、二级质谱数据进一步比对确认。对于无对照品的化合物，随后将得到的色谱图用 TOPPView软件打开，根据tR分析二级质谱数据，与METLIN（https：//metlin.scripps.edu）和 HMDB数据库中的二级碎片信息比对推断性地鉴定化合物。

2.2.4 成分识别 为苏合香在正离子和负离子模式下的UHPLC-QE-MS总离子流图见图2。结合一级、二级质谱信息、对照品信息，以及与METLIN 和 HMDB数据库中的二级碎片信息比对推断，初步鉴定出苏合香中的32个化学成分，即正离子模式下19个，负离子模式下13个，具体识别出的苏合香主要化学成分信息见表4和表5。

图2 苏合香 UHPLC-QE-MS 的总离子流图Fig 2 Total ion chromatogram of styrax based on UHPLC-QE-MS.

表4 正离子模式下苏合香 UHPLC-QE-MS 检测化学物质成分表征Tab 4 Identification of chemical components in styrax by UHPLC-QE-MS in positive ion mode

表5 负离子模式下苏合香 UHPLC-QE-MS 检测化学物质成分表征Tab 5 Identification of chemical components in styrax by UHPLC-QE-MS in negative ion mode

2.2.5 质谱解析举例 根据二级离子质谱裂解碎片与数据库或对照品对比，结合相关文献分析。识别出的化合物详细的MS/MS 数据见表4和表5。本试验以肉桂酸肉桂酯、肉桂酸苄酯、苯甲酸为例来阐明裂解途径。

肉桂酸肉桂酯的裂解途径见图3，在正离子模式下得到准分子离子m/z265.1223 [M＋H]＋，它在很小的碰撞能量下易发生酯键断裂，得到碎片离子m/z131.0489；继而失去CO分子，得到m/z103.0541碎片离子；m/z103.0541碎片离子发生断裂，脱掉侧链CH生成丰度较高的碎片离子m/z91.0540；经过正离子裂解途径分析，可确证该物质为肉桂酸肉桂酯。

图3 正离子下肉桂酸肉桂酯二级质谱图及裂解途径Fig 3 MS2 spectrum and fragmentation pathways of cinnamyl cinnamate in positive ion mode

肉桂酸苄酯的裂解途径见图4，在正离子模式下得到准分子离子m/z239.1067 [M＋H]＋，与肉桂酸肉桂酯相似，它可以在极低能量下发生酯键断裂，得到碎片离子m/z131.0487；再次失去CO分子，得到碎片离子m/z103.0541；m/z103.0541碎片离子发生断裂后继续脱掉CH产生碎片离子m/z91.0540；经过离子裂解途径分析，可确证该物质为肉桂酸苄酯。由以上可总结出肉桂酸酯类的裂解规律，如图5所示。

图4 正离子下肉桂酸苄酯二级质谱图及裂解途径Fig 4 MS2 spectrum and fragmentation pathways of benzyl cinnamate in positive ion mode

图5 肉桂酸酯类成分的裂解途径Fig 5 Fragmentation pathways of cinnamates

苯甲酸在正离子模式下得到准分子离子m/z123.0441 [M＋H]＋，与精确分子质量理论值相比，二级匹配的打分MS2score为0.9097，二级碎片离子为m/z105.0337 [M＋H-H2O]＋；在负离子模式下得到准分子离子m/z121.0285 [M-H]-，与精确分子质量理论值相比，二级匹配的打分MS2score为0.9811，二级碎片离子m/z77.0389 [M-HCOO]-，经过正负离子裂解途径分析，可确证该物质为苯甲酸（见图6）。

图6 正离子（A）及负离子模式（B）下苯甲酸二级质谱图及裂解途径Fig 6 MS2 spectrum and fragmentation pathways of benzoic acid in postive ion（A）and negative ion（B）mode

3 讨论

苏合香是一种由树脂和油状液体混合而成的复杂物质，仅依靠单一指标性成分进行鉴别，很难全面反映苏合香的内在质量差异。因此，建立一种同时测定多指标成分的方法十分必要。刘莉等[8]建立了同时检测苏合香中肉桂酸肉桂酯、肉桂酸苄酯、苯甲酸苄酯、苯甲酸的GC方法。苏德民等[9]通过GC-MS技术分离鉴定出苏合香中的73个成分，占总提取物色谱峰总面积87%。孙胜南等[10]应用GC-MS技术发现肉桂酸肉桂酯、肉桂酸3-苯基丙酯、肉桂酸、肉桂醇、肉桂酸苄酯和β-石竹烯是苏合香中含量较高的几种成分。此外，也有学者应用HPLC法检测出苏合香中肉桂酸乙酯、肉桂酸苄酯、肉桂酸肉桂酯、苯甲酸苄酯、甲酸、肉桂酸、脱氢松香酸、松香酸等成分[11-12]。目前对苏合香化学成分分析多为单一方法和个别指标的定性检测，尚未见苏合香多技术联用检测方法的报道，因此，全面分析苏合香化学成分轮廓对于其药效物质基础筛选及二次开发具有重要意义。

3.1 提取溶剂的选择

以甲醇和正己烷作为苏合香提取溶剂进行适宜性考察。结果表明，当使用甲醇作为萃取溶剂时，苏合香提取液不会出现乳化现象，并且检测到的色谱峰个数也更多。因此，本研究最终采用甲醇作为苏合香的提取溶剂，这一发现可为后续苏合香成分分析提供指导和借鉴。

3.2 GC-TOF-MS识别分析

当应用GC-TOF-MS识别苏合香的化学成分时，恒温方式很难实现良好的分离，并且会降低质谱检测的分辨率。共鉴定出苏合香提取物中 25个挥发性成分，占苏合香提取物色谱峰总面积的97.7%，其中含量较高的化学成分有肉桂酸肉桂酯（29.46%）、肉桂醇（11.17%）、肉桂酸苄酯（8.83%）、苯甲酸肉桂酯（6.69%）、石竹烯（2.47%）、肉桂醛（2.02%）、苯乙烯（0.77%）等，识别色谱峰总面积占比优于目前文献报道[9]。

3.3 UHPLC-QE-MS识别分析

当应用UHPLC-QE-MS识别苏合香的化学成分时，我们对流动相比例设置进行了考察，发现当水相中添加5 mmol·L-1乙酸铵和5 mmol·L-1乙酸时，苏合香的各成分质谱响应较好，分辨率最佳。由于苏合香中多含树芳香烃类和萜类成分，且部分成分极性十分接近，因此本研究最终采用了方法学中所述的梯度洗脱方式。在正离子和负离子模式下，均鉴定出了系列肉桂酸及其衍生物，且这些衍生物在不同文献中均有报道[10-11，13]。UHPLC-QE-MS识别分析出的代表性成分有肉桂酸、肉桂醛、肉桂酸肉桂酯、肉桂酸苄酯、苯乙酸肉桂醇酯、苯乙烯、苯甲酸等。此外，我们以正负离子模式下肉桂酸肉桂酯、肉桂酸苄酯和苯甲酸举例分析了裂解规律，为苏合香化学成分识别确认提供试验基础。

3.4 未来展望

苏合香质量标准现收载于 2020 年版《中国药典》一部，主要是针对苏合香性状、化学鉴别、薄层鉴别、酸值、皂化值、肉桂酸测定等的研究[14]。针对药典以苏合香中的肉桂酸作为质量鉴定成分，文献中多采用碱水解的方式测定水解后的总肉桂酸的含量，这种测定转化后的成分而不是选择测定原形成分，无法体现苏合香的成分类型，质控指标单一且专属性不强，可能会出现企业为达到《中国药典》的标准而掺伪掺假的情况[15]。本试验通过对苏合香提取物溶解性以及对其物质基础的了解，采用GC-TOF-MS联合UHPLC-QE-MS技术对苏合香进行化学成分轮廓研究，发现肉桂酸肉桂酯、肉桂酸苄酯、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛、苯甲酸、苯乙烯等成分可能是苏合香的代表性化学成分。因此，建议综合考虑苏合香标准中含量测定的指标以及前处理方法，增加测定方法的专属性。