不同晶型丹皮酚的药动学及抗痛经作用研究

周洪亮，王海丹，王泽琨，马丽娟*（.南京中医药大学附属医院 药学部，南京 009；.南京中医药大学附属医院 基础药理实验室，南京 009；.南京中医药大学 第一临床医学院，南京 0046）

丹皮酚（paeonol）是一种天然的酚类化合物，易溶于甲醇或乙醇，溶于热水，不溶于冷水[1]，是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.、萝藦科植物徐长卿Cynanchumpaniculatum（Bge.）Kitag.的主要活性物质。前期研究发现丹皮酚存在多晶型现象[2]，多晶型是固体化合物普遍存在的一种现象，晶型差异不仅影响药物的稳定性，而且影响其溶解吸收过程，从而影响疗效。丹皮酚固体制剂已在临床应用多年，由于其多晶型现象的存在，比较不同晶型之间的药物代谢动力学特点及药效差异对丹皮酚优势晶型的选择、药物质量水平的提高及临床疗效一致性的保证具有重要意义。

本实验在发现并表征丹皮酚6种晶型（Ⅰ～Ⅵ）的基础上，选取了体外溶出具有代表性的晶型（Ⅰ～Ⅲ）进行药动学研究[2]，并在前期发现的丹皮酚抗痛经作用[3]的基础上比较不同晶型的药效差异，以期为寻找其优势晶型奠定基础。

1 材料

1.1 试药

丹皮酚晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（自制[3]，不同晶型XRPD数据见表1），丹皮酚（批号：220503）、香豆素（批号：220425）（纯度均≥98%，南京聚康医药化工有限公司），羧甲基纤维素钠（批号：20190520，国药集团化学试剂有限公司），苯甲酸雌二醇注射液（2 mL/4 mg，批号：20220201）、缩宫素注射液（1 mL/10单位，批号：20220201）（合肥新科信动物药业有限公司），大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）、大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒、组织一氧化氮（NO）定量检测试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

表1 丹皮酚不同晶型XRPD数据Tab 1 XRPD data of different crystal forms of paeonol

1.2 动物

SPF级雌性SD大鼠，体重180～220 g [上海必凯科翼生物科技有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018-0006]。

1.3 仪器

Agilent 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），Sartorius BP-211D十万分之一电子分析天平（赛多利斯公司），高速冷冻离心机（贝克曼库尔特有限公司），多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；Eppendorf离心机、微量移液器（Eppendorf公司）；Pannoramic 1000全景切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH）。

2 方法与结果

2.1 药动学研究

2.1.1 溶液的制备

① 对照品储备液：精密称取丹皮酚对照品适量，置25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀，得到质量浓度为471.34 μg·mL-1的丹皮酚对照品储备液，备用。

② 内标溶液：精密称取香豆素适量，置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀，得到113.40 μg·mL-1的内标储备液。精密吸取内标储备液2 mL，置100 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，混匀，得到2.268 μg·mL-1的内标溶液，备用。

2.1.2 血浆样品的处理 精密量取待测血浆样品100.0 μL，置1.5 mL EP管中，加入香豆素内标溶液（2.268 μg·mL-1）100.0 μL及含0.1%甲酸的乙腈200.0 μL，涡旋1 min后12 000 r·min-1、4℃离心10 min，上清液在室温下用氮气吹干，100 μL流动相复溶，振荡2 min，离心，取上清液备用。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈-0.05%甲酸水溶液（50∶50）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30℃；检测波长：273 nm；进样量：10 μL。

2.1.4 专属性实验 取空白血浆（A）、空白血浆＋丹皮酚＋香豆素（B）及给药1 h的血浆样品＋香豆素（C），照“2.1.2”项下方法处理后，进样测定，得各样品色谱图见图1。结果表明，香豆素（内标）及丹皮酚的保留时间分别为2.8 min和4.5 min，且峰形好，血浆中的内源性物质与丹皮酚及香豆素分离度良好。

图1 丹皮酚高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of paeonol

图2 不同晶型丹皮酚在大鼠体内平均血药浓度-时间曲线图（n＝5）Fig 2 Plasma concentration-time curves in rats of paeonol different crystal forms（n＝5）

2.1.5 标准曲线的绘制及定量限 取空白血浆100.0 μL，置于EP管中，加入香豆素（2.268 μg·mL-1）100.0 μL，再分别加入0.024、0.118、0.236、0.589、1.178、2.357、3.535 μg·mL-1的丹皮酚对照品溶液100 μL及含0.1%甲酸的乙腈100 μL，涡旋1 min后12 000 r·min-1、4℃离心10 min，取上清液，室温下氮气吹干，用100 μL流动相复溶，进样测定。以丹皮酚质量浓度（Y）对丹皮酚峰面积与香豆素峰面积的比值（X）进行线性回归，标准曲线方程为Y＝0.3851X-0.0553（r＝0.9991），丹皮酚在0.024～3.535 μg·mL-1内与峰面积呈良好的线性关系，定量限为0.024 μg·mL-1。

2.1.6 精密度、准确度考察 取空白血浆100.0 μL，分别加入不同质量浓度的丹皮酚对照品溶液至终浓度分别为0.118、0.589、2.357 μg·mL-1，每种浓度平行制备对照品血浆5份。照“2.1.2”项下方法处理后，进样测定，记录峰面积。每个浓度同日内测定5次，考察日内精密度；连续测定3 d，考察日间精密度。以测得值与真实值的比值计算回收率，考察准确度。结果不同质量浓度的丹皮酚血浆样品的日内精密度RSD＜3.0%，日间精密度RSD＜4.0%，日内、日间回收率在81.2%～100.0%，表明本法精密度、准确度均符合相关要求。

2.1.7 提取回收率 分别配制质量浓度为0.118、0.589、2.357 μg·mL-1的含药血浆各5份，按照“2.1.2”项下方法处理后测定，得峰面积A；取空白血浆，按“2.1.2”项下方法沉淀蛋白后，取上清液分别加入0.118、0.589、2.357 μg·mL-1的丹皮酚对照品溶液，氮气吹干溶剂，复溶后同法测定，得峰面积B。提取回收率（%）＝A/B×100%，结果丹皮酚的提取回收率均在88.2%～96.6%，RSD＜5.0%。

2.1.8 稳定性 取空白血浆100.0 μL，分别加入不同质量浓度的丹皮酚对照品溶液，使终质量浓度分别为0.118、0.589、2.357 μg·mL-1，每种浓度平行制备对照品血浆5份，照“2.1.2”项下方法处理后，分别在室温放置36 h、-20～20℃反复冻融3次和-20℃放置30 d，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，考察稳定性。结果不同质量浓度的丹皮酚血浆样品经不同条件处理后的回收率在82.4%～101.0%，均符合要求。

2.1.9 药动学研究 15只SD雌性大鼠随机分成3组（每组5只），分别为晶型I组、晶型Ⅱ组、晶型Ⅲ组。给药前禁食12 h，自由饮水。每只大鼠分别单次灌胃给予同一粒径的（通过三号筛，不通过四号筛）不同晶型丹皮酚粉末138 mg·kg-1（以0.2% CMC-Na混悬[4]），分别于给药后0、15、30、60、90、120、150、180、240、300、360、420 min眼眶静脉丛取血0.4 mL置于肝素润洗过的EP管中，以3000 r·min-1离心10 min，取上清液100 μL，置于2 mL EP管中，照“2.1.2”项下方法处理，进样分析。计算不同时间点各晶型丹皮酚血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线，使用Phoenix WinNonLin 8.3.5软件进行非房室模型拟合计算主要药动学参数，采用GraphPad Prism 9.4.1软件对获得的组间数据进行单因素方差分析。根据血药浓度-时间曲线可知，晶型Ⅰ吸收较其他晶型慢，该结果与各晶型体外溶出行为具有一致性，晶型Ⅱ、Ⅲ药动学参数中的tmax、AUC0～7h、MRT0～7h与晶型Ⅰ相比差异显著。其中，达峰时间最长相差115 min，曲线下面积最大相差32.5%，平均滞留时间最大相差75.9 min。主要药动学参数统计结果见表2。

表2 不同晶型丹皮酚在大鼠体内药动学参数(n＝5)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of paeonol polymorphs (n＝5)

2.2 药效学研究

2.2.1 原发性痛经模型大鼠的制备及给药方案SD雌性大鼠25只，随机分成5组（每组5只），分别为正常组，模型组，丹皮酚晶型Ⅰ组、晶型Ⅱ组、晶型Ⅲ组。模型组和各给药组大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇，每日1次，连续10 d（第1日和第10日为2.5 mg·kg-1，第2～9日为1 mg·kg-1）[5]，于第3～10日分别灌胃给予同一粒径的（过三号筛，不过四号筛）不同晶型丹皮酚粉末138 mg·kg-1（以0.2% CMC-Na混悬）。

2.2.2 行为学测试 最后一次（第10日）丹皮酚干预后1 h，每只大鼠腹腔注射缩宫素注射液1U·kg-1[5]。以扭体潜伏期和20 min内扭体次数为行为观察指标，测定不同晶型丹皮酚对痛经模型大鼠的镇痛作用。大鼠扭体主要表现为腹部向内凹陷、躯干和后肢伸展、臀部和一侧的肢体内旋，有时还有抱头舔腹的行为[6-8]。

模型组大鼠均出现了明显的扭体反应，表明原发性痛经模型建立成功。与模型组比较，丹皮酚晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均能显著降低扭体反应次数（P＜0.001，分别减少80.2%、57.6%、52.5%），晶型Ⅲ与晶型Ⅰ相比有显著性差异（P＜0.05）。与模型组比较，丹皮酚对大鼠扭体潜伏期的影响虽然没有显著差异，但仍具有一定的延长作用。综合比较，丹皮酚晶型Ⅰ对扭体反应的抑制作用优于晶型Ⅱ、Ⅲ，见图3。

图3 不同晶型丹皮酚对原发性痛经模型大鼠扭体次数和扭体潜伏期的影响（n＝5）Fig 3 Effect of paeonol polymorphs on writhing latency and writhing times of PD rats（n＝5）

2.2.3 大鼠子宫中炎症因子含量的测定 扭体试验完成后，大鼠腹腔注射戊巴比妥（2 mg·kg-1）麻醉，剖腹，取出子宫后剪取200 mg组织在冰浴下制成10%的子宫组织匀浆，4000 r·min-1、4℃离心10 min，取上清液，用于PGE2、NO和TNF-α的测定。

结果与正常组比较，模型组子宫中PGE2、TNF-α含量明显升高，NO含量则显著降低（P＜0.01，P＜0.001），丹皮酚不同晶型均能促使原发性痛经模型大鼠子宫组织中PGE2、TNF-α、NO水平趋于正常化，而3种晶型中晶型Ⅰ改善最明显，见表3。

表3 不同晶型丹皮酚对原发性痛经模型大鼠子宫组织中PGE2、NO和TNF-α的影响(n＝5)Tab 3 Effect of paeonol polymorphs on PGE2，NO and TNF-α in the uterus of PD rats (n＝5)

2.2.4 组织病理学检测 分离大鼠子宫组织并浸泡于4%多聚甲醛固定液中进行固定，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切成5 μm的切片后进行HE染色，评价子宫组织病理学变化。结果正常组大鼠子宫组织形态正常，组织平滑形态清晰，上皮细胞单层柱状，排列整齐，腔壁结构各层完整、清晰。模型组大鼠子宫组织肌层结构紊乱模糊不清，固有层水肿，上皮细胞变性呈空泡样改变或坏死、脱落（红色箭头），炎症细胞浸润（蓝色箭头）。不同晶型丹皮酚给药后大鼠子宫病变均不同程度改善并趋于正常化，晶型Ⅰ组改善最明显。各组子宫内膜相对平整，空泡样改变大幅改善，固有层水肿消失，肌层纹理清晰，见图4。

图4 不同晶型丹皮酚对原发性痛经大鼠子宫组织病理变化的影响Fig 4 Effect of paeonol polymorphs on the histopathological changes in the uterus of PD rats

3 讨论

临床应用丹皮酚已有50多年的历史[9]，主要上市剂型有丹皮酚片、丹皮酚注射液等，它们对多种疼痛具有确切的治疗作用。多晶型现象是指一种化合物分子由于排列方式不同而形成的两种或者两种以上的晶型状态[10]。药物的不同晶型可影响药物的吸收和生物利用度，从而导致疗效的差异[11]。本课题组前期共制备并表征了丹皮酚6种晶型，体外溶出研究过程中发现，所制备的各晶型中，晶型Ⅲ在各介质中溶出均较快，晶型Ⅱ次之，晶型Ⅰ溶出最慢[2]，因此选取了上述3种晶型进行药动学及药效学对比研究。

本实验通过对大鼠口服不同晶型丹皮酚药动学及药效学进行比较，探讨晶型对于药物吸收及临床疗效的影响，因前期研究过程中发现丹皮酚抗痛经作用明显[3]，因此药效学比较选择了大鼠痛经模型作为研究对象。难溶性药物的晶型及粒径均可能对药物的吸收产生较大影响，本研究使用的丹皮酚为同一粒径的不同晶型样品，这样可以更好地反映晶型这单一因素对吸收、疗效的影响。

药动学研究对比了乙腈沉淀与乙酸乙酯萃取对样品处理效果的影响，结果采用乙酸乙酯萃取的血浆样品，丹皮酚的提取回收率仅50%～60%，且容易出现乳化现象，而乙腈沉淀法处理的血浆样品低浓度下回收率＞80%，中、高浓度回收率＞90%，且日内、日间精密度，稳定性均符合要求。

运用Phoenix WinNonLin软件对3种晶型丹皮酚在大鼠体内的相关药动学参数进行分析，结果表明，各晶型丹皮酚代谢均较快，大鼠口服半衰期仅30 min左右，无显著性差异。然而，根据丹皮酚血药浓度-时间曲线可见，晶型Ⅲ的吸收速度更快，达峰浓度更高，晶型Ⅰ则吸收缓慢，但是其平台期相对较长，180 min还存在一吸收峰，该现象可能与丹皮酚的肠吸收有关。不同晶型丹皮酚抗痛经作用效果存在差异，其中晶型Ⅰ在抑制痛经模型大鼠甩尾及子宫组织中炎症因子等方面优于其他晶型，分析可能与该晶型的溶解、释放速度有关，体内研究中晶型Ⅲ的达峰时间仅15 min，而晶型Ⅰ则达到了2 h，达峰时间显著延长，而丹皮酚的吸收、消除速度均较快，因此慢溶出的晶型能够维持较长时间的血药浓度，从而达到更好的治疗效果，这也提示丹皮酚制剂的开发应着重于缓控释制剂的研究，而非提高溶解度。

本研究阐明了晶型对丹皮酚药动学及药效学的影响。丹皮酚吸收、消除速度极快[12-13]，溶出、释放较慢的晶型Ⅰ可以较好地维持血药浓度，因而抗痛经作用优于其他晶型，具有更高的开发价值。本研究可为丹皮酚优势晶型的选择及固体药物制剂的开发提供参考。