补佳乐联合缩宫素建立小鼠原发性痛经模型

陈景伟，仝瑞晓，孙晓换，范丽洁，杜惠兰

(1.河北医科大学，石家庄 050091;2.河北中医学院，石家庄 050091)

原发性痛经是妇科常见病、多发病，严重者可影响患者生活质量，因此备受关注。由于人体研究的限制性，建立动物痛经模型对研究痛经的发病机制和防治具有重要意义。目前原发性痛经动物模型多采取雌激素联合缩宫素诱发扭体反应，常用雌激素为已烯雌酚和苯甲酸雌二醇，由于药物利润低及副作用大等原因，这两种药物临床已经很少应用;缩宫素多为腹腔注射，但应用剂量报道不一，目前有每只2 U［1］、2 U/kg［2］、20 U/kg［3］，有必要摸索最佳剂量。据报道相同方法建立的痛经模型，小鼠扭体次数约为大鼠的6 倍［4］，因此本研究采用目前临床广泛应用的补佳乐联合缩宫素诱发扭体反应，不同条件下，组间比较，筛选最佳条件，建立近交系小鼠痛经模型，为原发性痛经的研究建立一种理想、实用的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级近交系BALB/c 雌性小鼠82 只，6 ～8 周龄，性周期4 ～5 d，体重(18 ±2)g，购自河北省实验动物中心［SCXK(冀)2008-1003］，室温20 ～23℃，相对湿度:45% ～60%，12 h 光照/黑暗交替饲养。自由获取食物和水，实验于河北医科大学中医学院中药药理实验室进行［SYXK(冀)2011-0047］。

1.2 实验器械及药品

补佳乐(戊酸雌二醇片)，规格:每片1 mg，拜耳医药保健有限公司广州分公司产品，批号:222A;缩宫素注射液，规格:10 U/mL，上海禾丰制药有限公司产品，批号120509;0.9% 生理盐水，规格:每瓶500 mL，石家庄四药有限公司，批号120731608;蒸馏水(自制)。

1.3 补佳乐混悬液配制

补佳乐低剂量组(0.5 mg/kg):1 mg 补佳乐片研碎，溶于40 mL 蒸馏水中，配成浓度为1∶40 的混悬液作为补佳乐低剂量备用;补佳乐高剂量组(1 mg/kg):1 mg 补佳乐片研碎溶于20 mL 蒸馏水中，配成浓度为1∶20 的混悬液作为补佳乐高剂量备用。

1.4 不同浓度缩宫素配制

用10 U/mL 的缩宫素，稀释10 倍制成浓度为1 U/mL 的缩宫素备用;稀释2 倍制成浓度为5 U/mL的缩宫素备用;及10 U/mL 缩宫素备用。

1.5 补佳乐剂量的筛选

20 只雌性近交系BALB/c 小鼠随机分为2 组，分别灌胃不同剂量补佳乐，低剂量组(0.5 mg/kg)，每只小鼠灌胃容量为体重(kg)×20 mL(相当于人临床用药量的10 倍);高剂量组(1 mg/kg)，每只小鼠灌胃容量为体重(kg)×10 mL(相当于人临床用药量的20 倍)，连续12 d，于末次给药后1 h，分别腹腔注射缩宫素2 U/只，观察扭体反应并记录扭体反应潜伏期及扭体次数。筛选补佳乐给药最佳剂量。

1.6 补佳乐用药周期的筛选

12 只雌性近交系BALB/c 小鼠，每天灌胃补佳乐0.5 mg/kg，连续15 d，并于每天给药后1 h，腹腔注射缩宫素每只2 U，记录30 min 内扭体潜伏期及扭体次数。筛选最佳给药周期。

1.7 缩宫素剂量的筛选

30 只雌性近交系BALB/c 小鼠随机分为3 组，每组连续灌胃补佳乐0.5 mg/kg 共12 d 后，于末次给药后1 h 腹腔注射不同浓度缩宫素。每只0.4 U组腹腔注射1 U/ mL 缩宫素0.4 mL，每只1 U 组腹腔注射5 U/mL 缩宫素0.2 mL，每只2 U 组腹腔注射10 U/mL 缩宫素0.2 mL，筛选缩宫素最佳剂量。

1.8 腹腔注射缩宫素时间的筛选

20 只雌性近交系BALB/c 小鼠随机分为2 组，每组连续灌胃补佳乐0.5 mg/kg 共12 d 后，分别于末次给药后0.5、1 h 腹腔注射缩宫素每只2 U 诱发扭体反应，并记录30min 内的扭体潜伏期及扭体次数。筛选腹腔注射缩宫素的最佳时间。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差±s)表示，两样本比较用t检验，组间比较用单因素方差分析，以P ＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量补佳乐对扭体反应的影响

补佳乐0.5、1 mg/kg 连续灌胃12 d，并于末次给药后1 h 诱发扭体反应，结果表明，0.5 mg/kg 组与1 mg/kg 组扭体潜伏期及扭体次数无统计学差异(均为P ＞0.05)，见表1。因此确定较小有效剂量0.5 mg/kg 为适宜剂量。

表1 不同剂量补佳乐对扭体次数和扭体潜伏期的影响Tab.1 Effect of different doses of progynova on writhning frequency and latency in the mice

2.2 补佳乐用药周期对扭体反应的影响

补佳乐0.5 mg/kg，连续灌胃15 d ，每天观察扭体反应，结果表明，第3 天时扭体次数开始增多;从第4 天开始维持在高水平。第14 天扭体次数最多，明显多于第1、2、3 天，但于其他时间点无统计学差异。结合小鼠动情周期4 ～5 d，并且小鼠痛经模型的建立时间以10 ～15 d 为宜［4］，因此选择补佳乐连续给药三个动情周期即12 d 为给药周期。见表2。

2.3 不同剂量缩宫素对扭体反应的影响

连续灌胃补佳乐12 d 后，腹腔注射缩宫素每只0.4、1、2 U，诱发扭体反应，统计结果表明，每只2 U发生的扭体次数明显多于每只1、0.4 U，差异有统计学意义(均为P ＜0.01)。每只0.4、1 U 诱发的扭体次数相比无统计学差异(P ＞0.05)。每只2 U 扭体潜伏期明显短于每只1、0.4 U，差异有统计学意义(均为P ＜0.01)，每只0.4、1 U 扭体潜伏期相比无统计学差异(P ＞0.05)。见表3。因此以缩宫素每只2 U 诱发扭体反应为最佳剂量。

表2 补佳乐用药周期对扭体次数及扭体潜伏期的影响Tab.2 effect of progynova administration cycles on the writhing frequency and latency in the mice

表3 不同剂量缩宫素对扭体潜伏期和扭体次数的影响Tab.3 Effect of progynova at different doses on the writhing latency and frequency in the mice

2.4 不同时间腹腔注射缩宫素对扭体反应的影响

分别于末次给药后0.5、1 h 腹腔注射缩宫素每只2 U，均能诱发扭体反应，统计结果表明于末次给药后1 h 后腹腔注射缩宫素诱发的扭体次数明显多于0.5 h 组(P ＜0.05)，潜伏期明显短于0.5 h 组(P＜0.01)，差异有统计学意义。见表4。因此以末次给药后1 h 腹腔注射缩宫素为最佳时间。

表4 不同时间腹腔注射缩宫素对扭体反应的影响Tab.4 effect of progenova injected at different time points on the writhing in the mice

3 讨论

目前痛经在体动物模型多采用SD 大鼠［5-8］、Wistar 大 鼠［9-11］、KM 小 鼠［12-14］及ICR 小 鼠［15-16］。利用近交系小鼠建立痛经模型尚未见报道。近交系小鼠基因高度纯化，且具有长期遗传的稳定性和对实验的敏感性和一致性，因此对药物反应的结果比较一致，可以减少重复试验的次数，节省实验时间，故本实验选用近交系小鼠。痛经模型的建立需要致敏和致痛两个步骤［17］，补佳乐是天然雌激素类药物，每片含天然雌激素戊酸雌二醇1 mg，可刺激子宫内膜生长［18］，并能提高子宫肌对缩宫素的敏感性［19］，目前临床应用极为广泛，因此，本研究采用补佳乐作为致敏药物;致痛药物常选用缩宫素及前列腺素，而缩宫素应用更为广泛，并且缩宫素诱发的扭体次数明显多于前列腺素PGF2a［4］。缩宫素可作用于子宫平滑肌引起子宫强烈而持续的收缩［5］，这种收缩与痛经引起的子宫强烈收缩相似，因此常被用于痛经模型的致痛药物［15］。

本实验采用补佳乐联合缩宫素建立近交系小鼠原发性痛经模型，并对所需的最佳条件进行了摸索。结果表明补佳乐0.5 mg/kg 连续灌胃12 d，于末次给药后1h 腹腔注射缩宫素每只2 U 为最佳方案，能快速诱发扭体反应，扭体反应80%集中在注射缩宫素后15 min 内，成功建立原发性痛经模型。实验周期短，成功率高，所需药品容易购得，为研究原发性痛经的发病机制及药理作用的提供了理想模型。

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