基于HPLC-Q-TOF-MS技术的柳叶鼠李化学成分分析

孟祎，赵伊君，薛志鹏，王宁，白吉庆，2*，王小平，2（.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 72046；2.陕西省中药原料质量监测技术服务中心，陕西 咸阳 72046）

柳叶鼠李（RhamnuserythroxylumPallas）是鼠李科鼠李属灌木树种，稀乔木，高可达2 m，别名黑疙瘩、黑格铃、红木鼠李[1]，在《中华本草》《全国中草药汇编》上均有记载，具有清热除烦、消食化积之功效，但目前尚未有相关的临床研究报道，主要分布在内蒙古、青海、甘肃、陕西、河北、山西等省区，在海拔1200～2600 m山坡阴湿处或山谷灌丛中生长[2]。目前，国内对柳叶鼠李的研究主要集中在季节变化[3]和生物活性[4]方面，为了深入对其研究，本研究首先对其进行全面的化学成分解析。HPLC-Q-TOF-MS分析技术是现在中药成分研究领域中应用广泛的定性测定方法，可以尽可能地检测出中药所含的化学成分[5]，具有高速、高灵敏度以及高选择性等特点[6]。本试验运用HPLC-Q-TOF-MS技术对柳叶鼠李的化学成分进行鉴定分析，为柳叶鼠李的质量控制以及药效物质基础的研究提供依据。

1 材料

Vauquish Flex型超高效液相色谱系统、Q Exactive Orbitrap型质谱仪、Direct-Q3 UV超纯水一体机（美国Millipore公司），十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度：0.01 mg），KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），无水乙醇（天津市天力化学试剂有限公司），乙腈、甲酸均为分析纯。

鼠李素（批号：PS220817-07）、异鼠李素（批号：PS010460）、柚皮素（批号：PS0240-0025MG）、山柰酚（批号：PS011676）、芹菜素（批号：PS010177）、槲皮苷（批号：PS010791）（纯度均≥98%，成都普思生物科技股份有限公司）；秦皮素（纯度≥98.0%，批号：111731-200501）、芦丁（纯度≥90.5%，批号：100080-200707）、秦皮乙素（纯度≥98.0%，批号：110741-200506）、槲皮素（纯度≥ 96.5%，批号：100081-200907）、木犀草素（纯度≥ 98.0%，批号：111520-202107）（中国食品药品检定研究院）。

柳叶鼠李采于陕西省富县蒋家村，经陕西中医药大学王薇教授鉴定为鼠李科植物柳叶鼠李RhamnuserythroxylumPallas的叶（标本存放于陕西中医药大学中药资源普查样本储藏室，标本号：20210812LY）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的配制

精密称取柳叶鼠李粉末2 g，加入60%乙醇50 mL置玻璃瓶中，超声提取40 min（功率80 W，频率45 kHz），冷却后，经 0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液备用，即为供试品溶液。

2.2 混合对照品溶液的配制

精密称取适量各对照品，用60%乙醇溶解并定容，用0.22 μm微孔膜过滤，得混合对照品溶液（鼠李素、异鼠李素、柚皮素、秦皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、槲皮苷、芦丁、秦皮乙素、槲皮素质量浓度分别为0.09、0.22、0.17、0.15、0.09、0.13、0.38、0.09、1.05、0.16、0.11 mg·mL-1）。

2.3 色谱-质谱条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱：0～1.5 min，5%B；1.50～15 min，5%～75%B；15～20 min，75%～95%B；20～26 min，95%B；26～26.1 min，95%～5%B；26.1～30 min，5%B，体积流量0.3 mL·min-1；柱温35℃，进样体积5 μL。

2.3.2 质谱条件 喷雾电压3.5 kV，鞘气流量45 arb，辅助气流量10 arb，辅助加热器温度450℃，毛细管温度275℃，扫描方式采用正、负离子Full-ddMS2模式。

2.4 结果

如图1所示，通过 HPLC-Q-TOF-MS检测，通过质谱裂解碎片分析并结合文献报道数据[7-36]对照，在柳叶鼠李60%乙醇提取液中鉴定了138种化合物，结果如表1所示。

图1 柳叶鼠李的 HPLC-Q-TOF-MS正离子模式（A）和负离子模式（B）总离子流图Fig 1 Total ion chromatograms of HPLC-Q-TOF-MS by positive mode（A）and negative mode（B）for Rhamnus erythroxylum Pallas

表1 柳叶鼠李中化学成分解析结果Tab 1 Chemical constituents identified from the extracts of Rhamnus erythroxylum Pallas

续表1

2.4.1 黄酮类化合物的分析鉴定 黄酮类化合物是植物次生代谢产物，以游离态或与糖结合为苷的形式存在[7]，由于普遍具有相同的基本骨架，因此通常表现出相似的质谱裂解途径[8]，黄酮及其苷类在裂解过程中容易发生糖苷键断裂、C环的逆狄尔斯-阿尔德（RDA）裂解以及一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、水（H2O）等一些中性分子的丢失，本研究共鉴定或推断出黄酮类化合物60个。

化合物59的裂解过程如图2所示，化合物脱去了1分子鼠李糖产生的离子碎片峰m/z465.1018[M+H-Rha]＋，再失去1分子葡萄糖而得到的碎片离子峰m/z303.0497 [M+H-Rha-Glc]＋，也可以m/z303.0497碎片离子通过准分子离子m/z610.3118 [M+H]＋失去多糖直接生成，根据参考文献[9-10]，并与图2对比，鉴定该化合物为芦丁。例如化合物77，在tR＝6.613 min处检测到化学式为C15H10O7，分子离子峰m/z303.0486 [M+H]＋。主要进行两种方式的裂解，裂解方式1为C环的RDA裂解，产生特征碎片离子m/z153.0183 [M+H-C8H6O3]＋，裂解方式2为丢失C7H6O3形成离子碎片m/z165.0183 [M+H-C7H6O3]＋，与文献报道裂解方式一致[8，11]，故推测其为槲皮素，质谱图和裂解过程如图3。化合物105在负离子模式下，其准分子离子峰m/z271.0619 [M-H]-，根据元素组成综合分析预测可能的分子式为C15H12O5。母离子通过RDA裂解反应，产生m/z151.0032碎片离子和119.0495的碎片离子，结合以上信息以及文献研究[12]和质谱裂解规律可知，此化合物为柚皮素，可能的裂解途径见图4。

图4 柚皮素质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 4 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of naringenin

2.4.2 有机酸类化合物的分析鉴定 根据液质分析结果并参考相关文献，该类化合物在负离子模式下有较高的响应，大多具有很强的分子离子峰，由于结构中包含羧基和酚羟基，因此质谱裂解的过程中容易丢失H2O和-COOH，且易在羰基处断裂形成碎片离子[13-14]。

化合物2在负离子模式下保留时间是1.011 min，准分子离子峰是m/z135.0293 [M-H]-（C4H8O5），误差为4.44，主要的特征碎片离子为m/z59.0127 [M-HC2H4O3]-，m/z75.0076 [M-H-C2H4O2]-，m/z89.0233[M-H-HCOOH]-，结合质谱裂解规律，再结合参考文献[15]，推测出化合物2为L-苏糖酸（C4H8O5），质谱图见图5。化合物52的保留时间为5.825 min，准分子离子峰为m/z153.0189 [M-H]-（C7H6O4），特征碎片离子峰有m/z109.0287，是由准分子离子峰失去1分子CO2产生的，通过质谱裂解规律和文献报道[16]，确定该化合物为原儿茶酸，可能的裂解规律如图6所示。化合物44的准分子离子峰为m/z179.0350 [M-H]-，推测其分子式为C9H8O4。其二级碎片离子有m/z135.0445 [M-H-CO2]-，结合质谱裂解规律和文献报道[17-18]，推测其为咖啡酸，其可能的质谱裂解途径和质谱图如图7。

图5 L-苏糖酸质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 5 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of L-threonic acid

图6 原儿茶酸质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 6 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of protocatechuic acid

图7 咖啡酸质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 7 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of caffeic acid

2.4.3 氨基酸类化合物的分析鉴定 氨基酸为含有氨基和羧基的一类有机化合物，一般会丢失18、28、46，分别对应母离子丢失H2O、CO、COOH2的特征碎片，有些氨基酸会丢失17即NH3。化合物23，正离子给出准分子离子峰m/z166.0860 [M+H]＋，保留时间是2.113 min，在TOF-MS/MS中，分子离子分别丢失1分子HCOOH和NH3形成m/z120.0812[M+H-HCOOH]＋的碎片离子和m/z103.0547 [M+HHCOOH-NH3]＋的基峰离子，根据参考文献[19]，并推测其可能裂解途径，见图8。

图8 L-苯丙氨酸质谱图（A）及裂解规律（B）Fig 8 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of L-phenylalanine

3 讨论

目前关于柳叶鼠李叶化学成分研究的报道比较少，化学成分相关研究还有很大空间。《中华本草》《全国中草药汇编》等均有记载柳叶鼠李具有治疗消化不良的作用，但具体起到治疗疾病作用的成分是什么，并没有相关的文献记载，因此本研究首先采用HPLC-Q-TOF-MS技术对柳叶鼠李化学成分进行全面分析，共鉴定出138个化合物，但是具体起到治疗作用的成分以及作用机制，仍需要通过药效实验来验证。

HPLC-Q-TOF-MS技术作为鉴定中药中复杂化合物的有效方法，克服了传统中草药提取分离方法耗时长、效率低的缺点，能够在较短时间内完成化学成分分析工作，避免了提取分离的烦琐过程。本研究首次对柳叶鼠李叶中的化学成分进行全面定性分析，为进一步阐明叶鼠李叶的药效物质基础和质量控制提供了方法依据。