同时测定复方阿胶浆中间体中17 种化学成分的定量核磁方法

谢欣媛，杨嘉誉，潘坚扬，瞿海斌

浙江大学药物信息学研究所，浙江 杭州 310058

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波谱法能同时提供定性和定量信息，是一种非靶向分析工具。其定量基本原理是信号强度与产生特定共振的原子核数量成正比。通过向样本中加入已知浓度内标化合物，可以基于该比例关系实现相对定量，或结合摩尔质量换算实现绝对定量[1]。近年来，定量质子核磁共振（quantitative nuclear magnetic resonance，1H-qNMR）技术在制药、代谢组学、食品等领域有着广泛的应用[2-6]。1H-qNMR 具有样品制备简便、分析过程中不破坏样品、无需被测物对照品的特点，虽然其灵敏度低于质谱技术，但上述特点使其比常规色谱技术更便捷、快速，适用于混合物分析[7]，因此，在中药质量评价研究中具有优势[8-10]。

复方阿胶浆（Compound E’jiao Jiang，CEJ）源自明代医家张介宾《景岳全书》中的两仪膏，是一种补益剂，临床用于治疗气血两虚证[11]。其制备工艺的第一步是合并煎煮红参、党参、熟地黄和山楂，得到提取液。阿胶则单独加水煮沸，得到胶液。胶液与上述提取液混合后用碳酸钠调整pH 值，滤过后浓缩至指定密度，再进行酸碱调节和滤过，最终得到成品制剂[12]。

为探究生产过程中物质传递规律，确定会导致显著成分变化的工艺环节，需对中间体进行全成分分析。提取环节将化学成分从药材转移至溶剂，故提取液是物质传递规律研究的起点。提取液中化学成分可分为植物初级代谢产物、植物次级代谢产物和无机盐离子3 大类，其中初级代谢产物的含量最高，包括氨基酸、小分子有机酸、核苷等化合物。目前报道的定量方法，均以药效相关的植物次级代谢产物为主[13-17]，全成分视角尚且欠缺。

本研究基于1H-qNMR 技术开发了一种同时对其提取液中17 种化学成分准确定量的方法。该方法检测时间短、制样方式简单，能实现更全面的定量分析，为CEJ 的生产过程物质转移规律研究打下基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Bruker Avance III 600 型核磁共振光谱仪，德国布鲁克公司，配24 位自动进样器与5 mm BBO 探头，Topspin 工作站；XS105 型电子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；5425 型高速离心机、Multipette M4 手动连续分液器、Research plus移液器，德国Eppendorf公司。

1.2 试药

3 批CEJ 的4 味药材提取液样本（中间体）由东阿阿胶股份有限公司提供，批号分别为1907075、1909010、2020616。3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠（TSP，批号SZBA183XV，质量分数≥99%）、氘代水（D2O，氘质量分数≥99.9%）、缬氨酸（批号P500172，质量分数98.9%）、异亮氨酸（批号P500099，质量分数98.9%）、丙氨酸（批号P500110，质量分数98.9%）、苏氨酸（批号P500242，质量分数99.9%）、γ-氨基丁酸（批号BCCC4017，质量分数≥99%）、焦谷氨酸（批号BCCB9703，质量分数≥99%）、丙酮酸（批号G2119085，质量分数≥98%，20 ℃下密度1.267 g/mL）、尿苷（批号SLCB8621，质量分数≥99%）均购自美国Sigma-Aldrich 公司。乳酸（批号200617，质量分数98.30%）、乙酸钠（批号190810，质量分数99.80%）、柠檬酸（批号211019，质量分数99.80%）、琥珀酸（批号200524，质量分数99.61%）、氯化胆碱（批号201028，质量分数99.53%）、葡萄糖（批号200323，质量分数99.80%）、果糖（批号210519，质量分数99.80%）、蔗糖（批号190825，质量分数98.83%）、半乳糖（批号191016，质量分数99.37%）、富马酸（批号190914，质量分数99.47%）、甲酸钙（批号200805，质量分数99.35%）均购自上海融禾医药科技有限公司。去离子水由纯化水系统Milli-Q Synthesis（美国Millipore 公司）制备得到。

2 方法与结果

2.1 样品制备

精确称取50 mg TSP 于100 mL 量瓶中，用D2O定容至刻度，混合均匀，得到含0.5 mg/mL TSP 的D2O 溶液。将提取液11 000 r/min 离心13 min，取上清，与水以体积比1∶5 混合得到样品液。精密移取540 μL 样品液与60 μL 含0.5 mg/mL TSP 的D2O溶液混合均匀，并转移入5 mm 标准核磁管中，即得NMR 样品。

2.2 分析参数

使用Bruker Avance III 600 型核磁共振光谱仪记录所有样品的1H-NMR 图谱，光谱仪频率为600.13 MHz，测定温度为298 K。采用脉冲序列zg30优化中心频率（O1），采用水信号预饱和脉冲序列Noesygppr1d 采集样品的1H-NMR 图谱。

具体采集参数如下：采样数据点32 768，谱宽（SW）7 211.539 Hz，中心频率（O1）2 828.63 Hz，90°脉冲宽度（P1）14.40 μs，弛豫延迟时长（D1）15.00 s，混合时间（D8）0.05 s，采集时间（AQ）2.27 s，接收器增益（RG）为50.8，扫描次数（NS）为32，空扫次数（DS）为4。

2.3 数据处理

在TopSpin 3.6.5（Bruker Bio Spin）工作站中对得到的1H-NMR 图谱进行初步处理。首先用窗口函数并进行傅里叶变换，其中窗口函数选择指数函数模式，线宽（LB）取0.3 Hz。以TSP 信号峰（δ0.00）为参考，校正化学位移，并进一步进行手动相位校正和基线校正。

将完成上述处理的图谱数据导入MestReNova 14.0.0（Mestrelab Research S.L.）软件中。首先进行多点基线校正，算法选择Smooth Segments，再用“线性拟合”方法对定量峰和内标峰（TSP）进行积分，后根据式（1）计算各待测成分质量浓度[18]。

Cx和CTSP分别是待测化学成分和内标TSP 的质量浓度，Ax和ATSP分别是待测化学成分和内标TSP 的特征峰面积，Nx和NTSP分别是待测化学成分和内标TSP 的特征峰质子数，Mx和MTSP分别是待测化学成分和内标TSP 的相对分子质量

2.4 图谱信号峰指认与定量峰选择

前期对红参、党参、熟地黄和山楂分别进行了水提，并采集1H-NMR 图谱进行定性分析。本研究通过文献调研，结合前期定性分析结果，初步确定中间体的化学成分组成。在此基础上，通过数据库（Human Metabolome Database，https://hmdb.ca/）检索以及标准品图谱比对的方式，进行中间体的核磁谱峰归属，最后通过对照品加标法对指认结果进行确认。从1H-NMR 图谱（图1）中共归属出22 种化合物，包括7 种氨基酸（峰1 亮氨酸、峰3 异亮氨酸、峰2 缬氨酸、峰5 苏氨酸、峰6 丙氨酸、峰8焦谷氨酸、峰9 γ-氨基丁酸），7 种小分子有机酸（峰4 乳酸、峰7 乙酸根、峰11 琥珀酸根、峰12 柠檬酸根、峰10 丙酮酸根、峰21 富马酸根、峰22 甲酸根），6 种糖类（峰14 葡萄糖、峰16 果糖、峰17 蔗糖、峰18 半乳糖、峰15 甘露三糖、峰19 水苏糖）和2 种核苷类成分（峰13 胆碱、峰20 尿苷）。谱峰指认结果见图1，各化合物按峰化学位移顺序进行编号。

图1 CEJ 中间体的1H-NMR 谱峰指认Fig.1 Signal identification of 1H-NMR spectrum of intermediate of CEJ

逐一为成功归属的化合物选定定量峰。为保证定量结果的可靠性，要求定量峰的信噪比不小于10。最理想的定量峰应不与其他无关化合物峰重叠。由于中药为复杂混合物，常含有十余种甚至数十种组分，导致1H-NMR 图谱较为拥挤，实际定量工作中难以找到最理想的定量峰。对于重叠部分少的峰，若其积分受到的干扰非常小，则亦可选为定量峰。若化合物有多组峰，则优先选择响应更高的峰作为定量峰。葡萄糖、果糖、半乳糖在水溶液中存在不同构型，不同构型间会相互转化且处于动态平衡之中。为得到可靠的定量结果，以不同构型对应峰的峰面积之和来进行计算[19-20]。发现β-半乳糖对应的δ4.58 处的双峰受水峰压制影响，出现了严重的峰形扭曲，且存在较多重叠，无法用于定量。因此，选择α-半乳糖对应的δ5.27 处的双峰作为定量峰。本研究在相同条件下分析已知准确质量浓度的D-半乳糖溶液，通过式（2）换算，得出该定量峰实际对应的质子数，用于后续计算。最终为17 个化合物选定定量峰，各定量峰的峰型及位置如图2 所示，具体参数以及化学结构中对应的氢原子见表1 和图3，同一化合物编号与图1 相同。

表1 定量峰的具体参数Table 1 Parameters of quantitative peaks

图2 17 种化学成分定量峰Fig.2 Quantitative peaks of 17 chemical components

图3 定量峰在化学结构中对应的氢原子Fig.3 Corresponding protons in structures of quantitative peaks

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 将缬氨酸、异亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸钠、γ-氨基丁酸、焦谷氨酸、琥珀酸、氯化胆碱、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、尿苷、富马酸、甲酸钙对照品置于装有五氧化二磷（P2O5）的干燥器中，减压干燥24 h 以上。精密称取一定量的对照品，用去离子水定容，得到相应的对照品母液；移取一定体积的丙酮酸液体，用去离子水定容得到母液。设置7 档质量浓度梯度，取上述对照品母液以及去离子水配制不同质量浓度梯度的样品液。将样品液与“2.1”项配制的含0.5 mg/mL TSP 的D2O溶液以体积比9∶1 混合得到待测样品。

按“2.2”项所述参数采集样品的1H-NMR 图谱，并对目标成分的特征峰进行积分。以对照品和内标化合物的峰面积之比为纵坐标（Y），以待测样品中对照品和内标化合物的质量浓度比值为横坐标（X）进行线性回归。得到的17 个成分回归方程见表2，相关系数（r）均不小于0.999 5，证明该方法线性关系良好。

2.5.2 检测限与定量限 以化合物定量峰响应为3倍信噪比时的质量浓度为检测限，10 倍信噪比时的质量浓度为定量限。信噪比的计算利用MestReNova 14.0.0 软件完成，其中每个成分均取3 次结果的平均数。各成分的检测限与定量限结果如表2 所示。

2.5.3 精密度 随机取一批（批号1909010）中间体，按“2.1”项所述方法制备1 份供试样品，连续采集6 张1H-NMR 图谱，按“2.3”项所述方法进行图谱处理，并计算目标成分质量浓度。精密度结果用6 组质量浓度计算值的RSD 表示，结果见表2。各成分的结果均小于2.7%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性 随机取一批（批号1909010）中间体，按“2.1”项所述方法平行制备6 份供试样品，分别采集1H-NMR 图谱，按“2.3”项所述方法进行图谱处理，并计算目标成分质量浓度。重复性结果用6 组质量浓度计算值的RSD 表示，结果见表2。各成分的结果均小于2.5%，证明制样重复性良好。

2.5.5 耐用性 随机取一批（批号2020616）中间体，按“2.1”项所述方法制备1 份供试样品，分别于296.5、297.0、297.5、298.0、298.5、299.0 K 温度下进行分析，按“2.3”项所述方法进行图谱处理，并计算目标成分质量浓度。方法耐用性结果用6 组质量浓度计算值的RSD 表示，结果见表2。各成分的结果均小于2.6%，证明分析温度在296.5～299.0 K 波动时对测定结果无显著影响。

2.5.6 稳定性 随机取一批（批号1909010）中间体，按“2.1”项所述方法制备1 份供试样品，在室温下保存，分别于第0、2、4、8、12、24 小时采集1H-NMR 图谱，按“2.3”项所述方法进行图谱处理，并计算目标成分质量浓度。样品稳定性结果用6 组质量浓度计算值的RSD 表示，结果见表2。各成分的结果均小于2.6%，说明样品溶液在室温下存放24 h 内稳定性良好。

2.5.7 准确度 本研究通过2 种方式考察准确度。首先是加样回收试验，取已完成定量分析的批次（批号1909010），分别加入相当于原样品质量浓度80%、100%、120%的待测成分对照品，记为低、中、高质量浓度组，每组平行制备3 份样品进行分析。按“2.3”项所述方法进行图谱处理，并计算目标成分质量浓度。各成分的最终回收率结果取3 份的平均值，并计算RSD，如表2 所示。各成分的平均加样回收率在90.0%～105.0%，RSD 小于2.2%，证明方法分析准确度良好。

其次，将分析值与参考值作比，以考察所提出方法的分析准确度。将缬氨酸、异亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸钠、γ-氨基丁酸、焦谷氨酸、琥珀酸、氯化胆碱、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、尿苷、富马酸、甲酸钙对照品置于装有P2O5的干燥器中，减压干燥24 h 以上。精密称取一定量的对照品，用去离子水定容得到相应的对照品母液；移取一定体积的丙酮酸液体，用去离子水定容得到母液。设置高、中、低3 档质量浓度，取上述对照品母液以及去离子水配制不同质量浓度的样品液，以配制质量浓度为参考值。

将样品液与“2.1”项配制的含0.5 mg/mL TSP的D2O 溶液以体积比9∶1 混合得到待测样品。按“2.2”项所述参数采集样品的1H-NMR 图谱，并按“2.3”项所述进行数据处理，得出分析值。将分析值与参考值进行比较，结果用平均相对偏差（RD）表示，RD 值的计算式如式（3）所示，其中c和cr分别为分析值和参考值。结果缬氨酸、异亮氨酸、乳酸、丙氨酸、乙酸根、γ-氨基丁酸、丙酮酸根、焦谷氨酸、琥珀酸根、胆碱、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、尿苷、富马酸根、甲酸根的RD 分别为3.38%、3.43%、2.21%、2.77%、3.15%、3.32%、3.75%、3.28%、3.94%、2.89%、3.90%、1.69%、1.52%、3.89%、3.00%、3.49%、3.55%，结果显示，各成分的RD 值均在4.0%以内，证明方法分析准确度良好。

2.6 样本测定

对3 批CEJ 中间体样本进行检测，各项测定结果均高于定量限，且满足线性范围。17 个化合物的定量结果见表3。

表3 3 批CEJ 中间体中17 种化学成分的1H-qNMR 方法定量结果Table 3 Quantitative results of 17 chemical components in three batches of intermediate of CEJ

3 批中间体样本中，大多组分的质量浓度在0.1～1.0 mg/mL，质量浓度最低的是异亮氨酸，最高的是果糖。质量浓度低于0.1 mg/mL 的有缬氨酸、异亮氨酸和富马酸根。4 种糖类成分的质量浓度均大于1.0 mg/mL，其中葡萄糖、果糖质量浓度均大于15.0 mg/mL。

为评价该方法可定量成分总量，用干燥衡重法测定了3 批中间体的总固体含量，并计算可定量成分在总固体含量中的质量占比。结果见表4，3 批中间体可定量成分的质量占比分别为71.09%、84.44%、70.09%。另分别计算了氨基酸、小分子有机酸、糖类和核苷4 类成分的质量占比。结果显示，糖类的质量占比均高于65%，为CEJ 中间体中的主要成分，其余可定量成分质量占比不足5%。

表4 各类可定量成分质量浓度在总固体中的占比Table 4 Proportion of mass concentration of various measurable components in total solids

3 讨论

为证明所提出1H-qNMR 方法的可靠性，进行了一系列方法学考察。线性考察旨在评价测试结果与试样中被测物浓度成比例关系的程度，以相关系数为指标。精密度考察旨在评价多次测定所得结果之间的接近程度，重复性考察评价的是多次制样对测定结果的影响，耐用性考察评价采集温度发生变动时测定结果受影响的程度，稳定性考察评价样品在室温条件下存放时长对测定结果的影响，上述3项考察均以分析值的RSD 作为指标。准确度考察评价的是方法测定结果与实际值或参考值接近的程度，此处采用两种方式进行考察，其一为加样回收实验，以回收率作为指标；其二是通过配制标准品溶液得到参考值，计算分析值与参考值的RD 值来进行评价。

成功归属出的22 种化合物中，17 种（如表1所列）得到了理想的方法学考察结果，证明所提出方法可行且可靠。余下5 种化合物中，亮氨酸、苏氨酸、柠檬酸根均谱峰重叠相对严重，无法选定合适的定量峰，导致无法进行定量；甘露三糖和水苏糖虽分别选定了重叠最少的峰作为定量峰，但是在加样回收实验中得出的回收率非常糟糕，无法通过方法学验证，故无法准确定量。这一结果说明所选择的定量峰不够合理，峰重叠程度对积分产生了过大负面影响。

样品检测结果显示，批号2020616 的糖类质量浓度明显低于另2 批，其中果糖质量浓度约为另2批的70%，葡萄糖质量浓度约为另2 批的58%。化学成分的组成和含量决定了提取液的物理属性情况，由批号2020616 样本糖类含量最低可以推测其密度最低，该推论与实际密度测定结果相符。在药典中，密度为提取液、浸膏的检查项之一。由此展望，全面成分定量有望成为提取液、浸膏化学组成与关键物理属性关系发现研究的基础工作。

与目前广泛应用的基于液相色谱技术的定量方法相比，1H-qNMR 方法的分析范围更广，且一次检测可定量的成分数目更多，更适合混合物高效分析；检测快捷，检测单个样本的仪器占用时间在10 min以内，对高通量分析友好；定量无需建立随行标准曲线，大大减少对照品和有机溶剂的消耗，在降低时间和经济成本的同时更加环保。目前1H-qNMR 方法推广的主要阻力来自核磁波谱仪的高昂成本，设备共享平台的构建是一种解决方案。方法的局限性在于灵敏度相对较低，且NMR 技术不具备分离混合物的能力，化合物频域峰重叠会对定性和定量造成负面影响。如将低含量的植物次级代谢产物以及个别由于频域峰重叠导致无法正常进行核磁定量的成分利用色谱或质谱技术进行定量，则能弥补上述局限，从而实现真正的全成分定量分析，有望拓宽1H-qNMR 技术的适用范围。

综上所述，本研究基于1H-qNMR 技术开发了CEJ 中间体的定量分析方法，能同时定量17 种成分，包括4 种氨基酸、7 种小分子有机酸、4 种糖类以及2 种核苷，具有耗时短、定量信息全面、环境友好等特点，能作为CEJ 生产过程物质传递规律研究的基础工作，对实现制药全过程控制有积极意义。

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